反义核酸阿霉素偶联物逆转肿瘤细胞多药抗性的研讨.pdfVIP

反义核酸．阿霉素偶联物逆转肿瘤细胞多药抗性的研究* 任宇红 魏东芝 37) (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，生物化学研究所，上海2002 多药抗药。[生(Multidrug 生耐药的同时，对其他结构和作用机理不同的药物也产生交叉耐药性。肿瘤患者 在化疗过程中往往会表现出这种多药抗药性。多药抗药性已成为肿瘤化疗失败的 主要原因。肿瘤细胞多药抗药性的形成原因很复杂，但其产生的主要机理是由于 化疗药物从癌细胞中泵出而导致化疗失败[21。多药抗药性现象己构成临床化疗的 一大障碍。近年来随着反义技术的兴起，利用反义核酸来调控mdrl基因的表达， 从而达到逆转肿瘤细胞多药抗药性现象，为克服这一难题带来了希望口J。我们在 大量研究反义核酸逆转人表皮肿瘤细胞KB—A一1多药抗药性的基础上，对反义核 酸进行阿霉素共价偶联修饰，以改善反义核酸片段的亲和性、稳定性和通透性， 同时借助阿霉素这一有效的DNA嵌入剂对目标DNA进行嵌入、交联或切断，以提 高反义核酸的功效。 l_偶联物性质 偶联物在PBS中的稳定性实验结果显示：阿霉素的吸光值在PBS中保温72 小时之后，其480tim的吸光值只有起始时的72％，阿霉素和寡核苷酸的混合物的 情况略为好一些，但也只有75％，而寡核苷酸一阿霉素偶联物则有较大的提高， 其72小时后的480hm的吸光值为起始时的85％，说明阿霉素与寡核苷酸偶联之 后其稳定性有一定的提高。阿霉素的稳定性与其氨基的稳定性相关，阿霉素的氨 基是个活泼基团，将其变成酰胺键之后，阿霉素的稳定性就会有不同程度的提高。 在血清中的稳定性实验结果如图1所示。 偶联物 对照组 图1．反义核酸．阿霉素偶联物在血清中 的稳定性．变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图 从图l可以看出，在未灭活的小牛血清中，经24小时保温后，未经修饰的 同序列的反义核酸大多已被降解，而反义核酸．阿霉素偶联物则未出现这样的情 况。HPLC定量分析可以看出，经24小时保温之后，有15．8％的反义核酸一阿霉 素偶联物被降解，而未经修饰的同序列的反义核酸则有97．2％被降解。说明将阿 霉素与反义核酸共价偶联之后，反义核酸的稳定性有了很大的提高。由于天然的 寡核苷酸在体内或细胞内最主要是被3、核酸外切酶所降解，因此，把一些适当的 化合物连接到寡核苷酸的3’末端，就可以有效地抵抗核酸酶的降解。我们的实验 结果证实了将阿霉素共价偶联到反义核酸片段上，可以显著提高抗核酸酶的降 149 解，提高了反义核酸的稳定性。 与靶基因序列结合熔点益线如图2所示。从图2可以看出，未经偶联修饰 的寡核苷酸与互补序列DNA的解链温度Tm为62℃，而反义核酸一阿霉素偶联 物与互补序列的解链温度Tm为74℃，比未经偶联修饰的反义核酸有明显的提 高。这个结果表明，反义核酸经修饰之后与其互补链的亲和能力有明显的提高。 2． 反义核酸邛可霉素偶联物对人表皮癌细胞KB．A一1多药抗药性的逆转作用 ● 09 O8 O7 d占。口N葛8§qJo昱日p^T瓮面暖 O 30 50 70 90 Temperature(℃) 图2．寡核苷酸一阿霉素偶联物熔点曲线图。 (·)：未经修饰的寡核苷酸．(▲)：寡核菅酸一阿霉素偶联物。 鲫 ，毒 ＼， ∞ {孓～≮≮ 鲁lI嘎l^一苟u ¨ j弋 --一五0。羔芝醚 { 茧 一一i击习Ⅱ ． 卸 ／ ＼ 。 j．．，．．毒=≥#；书～，