多重PCR对大熊猫和野生动物肠道分离菌氨基糖苷类抗生素耐药基因检测研讨.pdfVIP

经济动物传染病 多重PCR对大熊猫和野生动物肠道分离菌 氨基糖苷类抗生素耐药基因检测研究水 张安云1，王红宁“2，周万蓉1，柳萍3黄勇3，杨鑫3，夏青青3，刘立3，曾喻虹3，吴琦4 (9)1l农业大学资环学院，雅安四川625014；2．四川大学“985工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平 台，成都，6100613．四川农业大学动物科技学院，雅安四川625014； 4．四农业大学生命科学与理学院，雅安四川625014) 摘要本实验组从四川卧龙和碧峰峡大熊猫保护基地的30只大熊猫和16种野生动物的粪样中分离鉴定出 了83株革兰氏阴性肠杆菌。并选用氨基糖苷类药物(链霉素，卡那霉素、庆大霉素和新霉素)，用K．B法 进行药敏实验．结果表明，这些分离茵对链霉素的耐药率最高(28．91％)，其次为卡那霉素和庆犬霉素分别 为12．05％、7．29％，对新霉素的耐药率最低，只有6．02％．并根据Genbank上发表的募基糖苷类抗生素的 四种主要修饰酶基因(aminoglycosides-modifyingenzymes，AMEs)：aphA3、aacC4、aadA、aacC2设计了 四对引物，结果分剐扩增出了四条与预期大小一致的产物，序列分析表明扩增产物与G雠bank中的相应序 列有很高的同源性(97．8％)。同时，建立并应用四重PCR方法检测分离的83株细菌中AMEs基因流行分 和aacC2基因(9．64％8／83)，aacC4基因的检出率最低(2．41％2，83)． 关键词大熊猫野生动物多重PCR氨基糖苷类耐药基因检测 如果说抗生素的发现是人类第一次征服细菌，那么细菌产生耐药性则是向人类智慧提出 的又一次严峻挑战。随着抗生素大量而广泛的使用：细菌的耐药性问题也在全球泛滥开来， 不断有研究表明细菌的耐药性在世界各地随着时间的推移变得越来越广泛和严重【l’2】。去年 在我国的一个男童身上甚至还有分离到全耐药细菌(pan．陀sist；嘲ce)的报道。细菌的耐药趋势 及其耐药机理的研究已经迫在眉睫。本研究拟对我国的国宝——大熊猫，以及生活在相对闭 塞的野生动物的耐药情况进行调查，采用常规的K．B药敏实验和分子生物学的多重PCR方 法来检测它们粪样分离菌的耐药性及耐药基因的情况，以期为细菌耐药性及其耐药基因提供 更广泛而深入的资料。氨基糖苷类抗生素是兽医临床上使用最多最广泛的一大类抗生素，研 究表明其耐药机理也相对较为复杂，但耐药菌株产生产生氨基糖苷类抗生素修饰酶 (aminoglycosides—modifyingenzymes，AMEs)是其最主要的耐药机制。本研究选用针对氨基 b、aacC2对分离到的 糖苷类抗生素主要的四个AMEs基因：aphO’)．IIa、aadA、aac(6)．I 83株细菌进行四重PCR检测。现将研究情况报告如下： 1实验材料 1．1实验菌株 种野生动物(黄虎、小白虎、蜂猴、金丝猴、梅花鹿、白居鹿、黄鹿、长颈鹿、海狮、白狮、 狮子、大象、袋鼠、斑马、狼、骆驼)的粪样中分离鉴定出了83株革兰氏阴性肠杆菌。其中 大肠杆菌5l株、沙门氏菌24株、克雷伯氏菌5株、阴沟肠杆菌3株。大肠杆菌标准菌株： ATCC25922；沙门氏菌标准菌株：C79．13(购自卫生部药品生物制品鉴定所)；PCR阳性 菌株：E99(aph(3’)·IIa、aac(6)．I 由四川农业大学动物科技学院预防医学生物工程实验室保存。 1．2药敏试验 庆大霉素，卡那霉素，链霉素，新霉素(购自杭州微生物试剂有限公司) 1．3主要生化试剂 “资助项目：国家“十五”重点科技攻关子课题(2002BA514A一12—5)。 国家农业科技成果转化基金项目(合同号：05EFN215100243) 一作者简介：张安云(1981)，男，重庆云阳人，硕士研究生，主要从事动物细菌性传染病分子生物学研究． E-mail：zhanganyunl981日yahoo．com．CII 一“通讯作者：王红宁，女，教授、博士生导师，主要从事畜禽传染病、微生物生物工程的研究．电话： 0835—2886083 B—mail：whongning日163．tom 第六届理事会第二次会议暨教学专业委员会2006年会议论文集 TaqDNA聚合酶，Mg