生物制药专业实验课件（吉林大学）鱼鳞中胶原蛋白的提取与鉴定.docVIP

项目名称 鱼鳞中胶原蛋白的提取与鉴定 经 费 3000（元） 起止时间 2012年11 月至 2013 年 8月 负责人 学号 姓名 年级 专业 联系电话 E-mail 野恒 10级 基地一班 一、立项背景和依据（包括研究目的、国内外研究现状分析、研究意义，应附主要参考文献）（一）研究目的. 它通过产生一系列多肽来调节T 细胞的成熟、分化和功能. 1972 年Goldstein 等人对胸腺组织进行提纯和鉴定, 发现了其中一种分子量为12 600 Da 的活性成分[ 1] . 后续研究又表明该蛋白是由3 个分子量低于4 000 的多肽聚集而成. 胸腺素组分5 就是其中之一, 它具有强大的免疫促进作用, 甚至在胸腺摘除或免疫缺陷的动物体内可替代胸腺重新构建免疫功能[ 3]. ?? （二）国内外研究现状分析A1 ( TA1 ) 是20 世纪70 年代后期Goldstein等人发现的胸腺提取物第5 组份( TF5) 中的一种成份, 是一种针对T 细胞的免疫增强剂[ 1-2] 。通过对其氨基酸序列的测定得知, TA1 是由28 个氨基酸组成的酸性较强的多肽, 分子量为3108, 等电点为412, N 端被乙酰化。体内及体外的活性测定结果表明, TA1 的活性较TF5 高10 到1000 倍[ 3- 4] 。成年人胸腺开始退化, 推测TA1 在体内的合成也开始急剧减少。从动物胸腺组织中提取胸腺肽, 其原料来源有限, 纯化步骤复杂, 而且TA1 在提取的胸腺肽中含量极低, 仅为0156% ~ 110%。目前临床上所用的TA1制剂均为化学合成制备, 但是采用化学合成的方法成本较高, 且合成的杂质较多, 不易纯化, 还会造成环境污染[ 7] 。采用基因工程菌发酵生产TA1, 有着多样的设计及分离纯化工艺, 且各有优缺点, 大部分虽得到了成功表达, 但由于表达量低, 后处理工艺复杂, 成本较高,收率低, 也均未能真正实现产业化。本文针对分离纯化的费用占整个项目费用70% 以上的问题, 为了降低后处理的成本、提高产量, 1972 年Goldstein 等人对胸腺组织进行提纯和鉴定, 发现了其中一种分子量为12 600 Da 的活性成分. 后续研究又表明该蛋白是由3 个分子量低于4 000 的多肽聚集而成[ 2] . 胸腺素组分5 就是其中之一, 它具有强大的免疫促进作用, 甚至在胸腺摘除或免疫缺陷的动物体内可替代胸腺重新构建免疫功能[ 3]. 胸腺素组分5 是由分子量从1 000到15 000 不等的10 至15 种主要成分和20 多种次要成分所组成. Goldstein 通过对组分5 的进一步纯化, 获得了胸腺肽A1 ( thymosin A1, T hyA1) 并对其氨基酸序列进行了测定.T hyA1 由28 个氨基酸组成, 分子量为3 108, N_末端存在乙酰化, 其等电点为4. 2. 体内及体外的活性测定结果表明, 胸腺肽的活性较组分5 高10 到1000 倍. 临床数据表明ThyA1 能够显著增强机体的免疫力, 对肝炎病毒的复制繁殖具有显著的抑制作用. 胸腔组织中成分复杂, 因此天然ThyA1 的纯化步骤复杂, 且得率很低. 目前临床使用的ThyA1 是采用化学合成制造, 生产成本较高. 本文采用基因工程技术制备了重组人胸腺素A1( rhThyA1) , 并对其生物活性进行了鉴定.胸腺肽是胸腺素5种组分中活性最强的多肽之一, 由Go ldste in 等于1977 年首次在胸腺组织中发现。胸腺肽A1 是一种免疫增强剂和免疫调节剂, 在临床上得到广泛应用, 对乙型肝炎和丙型肝炎有显著疗效, 对自身免疫性疾病也有一定疗效。 异丙基-B-D-硫代( IsopropylB-D-1-thiogalatopyranoside,IPTG)是一种常用的诱导剂, 常用于重组蛋白的表达, 但由IPTG具有潜在的毒性[ 5] , 而且价格昂贵, 在大规模发酵中有一定的局限性。实验在重组人胸腺肽A1的表达中用乳糖代替IPTG 作为诱导剂的可行性, 并对用乳糖作为诱导剂时的各种诱导条件进行了研究, 以确定其相关的诱导条件[ 6]。 （三）研究意义A1 ( TA1 ) 对乙肝、丙肝、恶性肿瘤、重型病毒性肝炎、流行性乙型脑炎的治疗效果明显, 并且副作用少, 此外TA1 在心血管疾病和男性不育的治疗中也有显著的作用。构建了含有TA1 融合蛋白的编码基因的高表达基因工程菌, 用来表达重组人TA1 ( rhTA1) , 并对纯化工艺进行了优化。胸腺在动物的免疫系统中发挥着至关重要的作用. 它通过产生一系列多肽来调节T 细胞的成熟、分化和功能. （四）主要参考文献 1] Goldstein A L, Guha A,