定量溶血分光光度计法QuantitativeHemolyticSpectrophotometric.PPTVIP

体外抗体形成细胞的检测—定量溶血分光光度计法(QHS)(Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination) 原 理 用绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，然后将免疫活性细胞（小鼠脾脏B淋巴细胞）、SRBC和补体在液相介质中进行反应。SRBC与抗体形成细胞所产生的IgM结合形成抗原抗体复合物，激活补体系统，裂解SRBC而释放出血红蛋白，以分光光度计定量测定。所测值反映了抗体形成细胞产生抗体的功能。 实 验 步 骤 SRBC及其制备 脱纤维防凝处理的SRBC，以NS洗涤二次，每次2000rpm 离心5min。弃上清，制成SRBC悬液，然后用血细胞计数板计数细胞，最后稀释成1.5×108 sRBC/ml。 补体 新鲜豚鼠血清，用前经SRBC吸收后，用RPMI1640稀释。 （方法在新鲜的豚鼠血清中加入经洗涤3次的压积SRBC，按血清与SRBC体积比为5:1加入。4℃吸收30min后，3000rpm离心15min，吸出的上清即为RBC吸收的豚鼠血清。临用前1：10稀释。） 免疫小鼠脾细胞的制备 1）免疫鼠制备：取上述稀释的SRBC，经尾静脉或腹腔内注射免疫小鼠?（鼠龄8～10周），每只0.2ml。 2）取脾脏：72小时拉颈处死，取出脾脏用含5%小牛血清的Hanks液清洗，去除脂肪和结缔组织。 3）收取脾细胞： ①在200目铜网上研磨，并用含5%小牛血清的冷Hanks液冲洗，制备单个脾细胞悬液，转移滤液至试管内。1500rpm离心5min。 ②裂解红细胞：5ml Tris·NH4Cl重悬细胞，37℃孵育5分钟。 ③用含有5%小牛血清的Hanks液洗涤一次，用1.2ml Hank’s液重悬细胞。 正式实验 注意事项： 1.SRBC要新鲜，无溶血。 2.离体脾细胞的制备过程要迅速，以防细胞死亡，细胞计数应准确。 3.红细胞裂解是本实验的关键，应用力吹打，时间也要严格控制。 抗体制备 原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系统，B细胞活化并分化为浆细胞，产生针对特定抗原的特异性抗体。 方法 1.用移液管吸取脱纤维防凝处理的绵羊血适量 2.加2-3倍体积生理盐水，混匀，2000rpm离心5分钟，小心吸尽上清。 3.重复第二步操作。 4.用生理盐水配20%、25%、30%、40%和50% 绵羊红细胞（SRBC） 5.腹股沟皮下免疫小鼠，0.1ml/只,免疫三次。 6.取脾脏检测B细胞 * * SRBC 脾脏B细胞 SRBC 补体 ＋ ＋ 补体经典激活途径 SRBC裂解 分光光度计检测 3ml — 1ml 1ml 1ml 实验管 3ml 1ml 1ml 1ml — 对照管 总体积 Hank’s液 补体 SRBC悬液 脾细胞悬液 1. 取两支试管，标记 2. 按下表加试剂 3. 混匀，37℃水浴1小时。 4. 3000rpm 离心 5 min，取上清 5.721分光光度计测413nm处OD值（Hb量） 细胞计数法 RBC WBC WBC WBC WBC 1mm 1mm 细胞浓度/ml = 4个大方格中的细胞总数/4 × 104 细胞浓度/ml = 5个中方格中的细胞总数 ×5 ×104 1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=0.1×10-3ml =10-4ml 细胞浓度: 细胞数/ml =5个中格的细胞数 ×5×104（RBC计数法） 细胞数/ml = 4个大格的细胞总数/4 ×104 （WBC计数法） W W W W 1mm * * *