高相对分子质量裂褶多糖的制备与结构鉴定出境.docVIP

高相对分子质量裂褶多糖的制备与结构鉴定出境　　叶　诚　周蓬蓬　余龙江　何　峰　鲁明波 摘 要：以裂褶茵(Schizophyllum commune)发酵生产的培养物为研究对象，经过活性炭脱色、Sevag法脱杂蛋白、乙醇沉淀得粗多糖，再经Sephadex G-200柱层析分离纯化得裂褶多糖纯品，通过Sephadex G-200凝胶层析法测得其平均分子质量为436kDa；由气相色谱、红外光谱、高碘酸氧化、Smith降解、13C核磁共振等方法表征其化学结构，推测其结构为具有(1→6)分支的β-(1-3)-D-葡聚糖：其组成重复单元应该合有3个主链糖基和一个单糖分支，主链的取代发生在C-1和C-3之间，即为1→3糖苷键；分支发生在C-1和C-6之间，即为1→6糖苷键，其中分支点在主链糖基的C-6上。 　　关键词：裂褶菌；胞外多糖；分离化；结构鉴定 　　中图分类号：Q93 　　文献标识码：A 　　文章编号：1007-7847(2007)02-0100-05 　　 　　多糖是一类大分子化合物，一般由一百个以上甚至几千个单糖通过糖苷键连接而成，近年来，随着分子生物学和细胞生物学的发展，人们得到了有关糖的结构和功能越来越多的信息，逐步认识到糖是除核酸和蛋白质之外另一重要的生命物质，具有多种生物学功能，多糖尤其是相对分子质量大于50kDa的高相对分子质量多糖，在增强免疫、抗肿瘤等方面具有显著的生物活性，本文以裂褶菌(Schizophyllum commune)发酵培养物为研究对象，从中提取粗裂褶多糖，并由该胞外多糖(Schizophyllan，简称SPG)进一步分离纯化得到一种高相对分子质量裂褶多糖SPG13，分析了纯多糖的理化性质，为进一步开发应用奠定了重要基础。 　　 　　1材料和方法 　　 　　1.1材料 　　1.1.1 菌种 　　本研究菌种购于中科院微生物研究所菌种保藏中心，经鉴定，确定其为裂褶菌(Schizophylluncommune)。 　　1.1.2主要试剂与仪器 　　Sephadex G-200，蓝色葡聚糖和标准相对分子质量多糖(Dextram T-10，Dextram T-40，DextramT-70，Dextram T-500)(Pharmacia公司)，其他试剂均为进口或国产分析纯，UV-2100型可见紫外光分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；GC一9790气相色谱仪；VERTEX-70傅立叶变换显微红外／拉曼光谱仪，德国Bruker公司；AV400双通道全数字化傅立叶超导核磁共振谱仪，瑞士Bruker公司。 　　1.1.3样品制备 　　以裂褶菌发酵培养物为材料，收集发酵液，8000r/min，离心20min，弃沉淀，上清液中加入粉末状活性炭，水浴，加热搅拌15min，抽滤，滤液置于旋转蒸发仪中，浓缩体积后得粘稠、透明状液体，脱色后的发酵液用Sevag法除蛋白，重复3次后，向已脱蛋白的发酵液中加入2.5倍体积的95％乙醇，出现大量白色絮状沉淀；摇匀，4℃静置过夜，6000r/min离心20min，收集沉淀，冷冻干燥，得粗多糖。 　　 　　1.2方法 　　1.2.1 SPG多糖的理化性质的测定方法 　　观察SPG粗多糖的颜色、状态和溶解情况，并进行化学性质实验：苯酚—硫酸反应、蒽酮，硫酸反应， 　　1.2.2柱层析纯化 　　脱色，脱杂蛋白后的SPG粗多糖进行柱层析分离、纯化，分别选取Sephadex G-100、SephadexG-150、Sephadex G-200为填料装填于1.6cm×100cm层析柱中，比较其以0.5％和0.9％氯化钠溶液洗脱时的分离效果，流速控制在大约0.3mL/min，每管收集3mL，分部收集，每管取少量收集液，苯酚一硫酸法检测，490nm测其OD值，按照管号对光密度绘制洗脱曲线，对比洗脱效果，选取最适洗脱条件；选取最佳填料与条件进行多糖的纯化，将最大峰处的洗脱液合并，减压浓缩，冷冻干燥，得到多糖纯品。 　　 　　1.2.3 紫外及红外光谱分析 　　试样配成0.1％水溶液，对190～400nm区间进行紫外扫描，SPG1粉末经KBr压片，在4000am-113～500CB-1区间进行红外扫描。 　　1.2.4 Sephadex G-200凝胶过滤测定相对分子质量 　　称取SephadexG-2008.5g，加双蒸水溶涨72h，装填于层析柱中(1.6 cm×100cm)，用0.9％氯化钠水溶液平衡3d，分别称取已知分子质量的葡聚糖T500、T70、T40、T10和蓝色葡聚糖各3mg，用少量蒸馏水溶解后依次上柱，用0.9％氯化钠水溶液洗脱，每3mL收集一管，苯酚一硫酸法显色，490nm测其OD值检测各糖的洗脱体积Ve，用蓝色葡聚糖测出外水体积