反转录实验步骤总结.docVIP

一．前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA 100ng为计算标准） 1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol 2ml（共4ml），也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。 2.一个材料作二次生物重复，需要4根Zymo RNA纯化柱。一个标准Zymo Kit有100个反应柱子，也就是可以做25个材料。 3.RNA fragmentation完整Kit可以做100个样品。 4.mini/midi Kit可以做12个柱子反应。 二．前期准备工作 1.DEPC处理的水； 2.RNA专用的75%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc； 3.220℃烘烤6小时的研磨棒、器皿和药匙； 4.足够的液氮； 三．其它小知识 理论上，每100mg材料可以获得100-200ug total RNA，纯化后获得的mRNA的量约为total RNA量的1/100。 四．具体实验步骤 （一）TRIzol提取总RNA 先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。 准备好TRIzol管，每50-100mg材料加入1mlTRIzol（材料体积应小于TRIzol体积的10%），振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2分钟可）。 悬液室温放置5min(可30min放置)。再加入1/5V（起始体积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。然后13000rpm 2-8℃ 离心30 min。 吸取无色上清（约有1/2的起始体积量），加入1/2 V（起始体积）异丙醇。室温放置10 min。然后13000rpm 2-8℃ 离心30 min。 弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（1ml乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm 2-8℃ 离心10min。 空转一次，吸去上清。 适当干燥5 min。加入经DEPC处理的水100ul，冰浴1小时。 检测：2μl电泳检测，另取1μl稀释10倍后测OD值。 【用RNase free 的Dnase酶切。（一般100ug 的总RNA中加4%-5%V的RNase inhibitor和10-20U的 Dnase，然后37℃ 30 min）。】 如果暂时不用，可以加1/10V的3M PH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80℃放置2小时以上或overnight。然后12500rpm 2-8℃ 离心15 min，重复step 5-7。 （二）从总RNA提取mRNA（Oligotex mRNA Midi Kit）（REPEAT） (NOTE: Oligotex、OBB先37℃预热，然后振荡，25℃备用。OEB 70℃预热。) 根据以下表格依次混合在1.5ml微离心管内。须充分混合。 total RNA add Rnase-free water to total RNA sample: Buffer OBB(μl) Oligotex Suspension(μl) =0.25mg 250μl 250 15 (mini Kit) 0.25-0.50mg 500μl 500 30 (midi Kit) 0.50-0.75mg 500μl 500 45 (midi Kit) 0.75-1.00mg 500μl 500 55 (midi Kit) 在70℃水浴3 min。再室温放置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。（可将所弃上清液另外保留，第一遍提取结束后回收原先的Oligotex再次加10μl 新的Oligotex，第二遍提取mRNA。） 沉淀用等体积的OBB和Rnase-free Water充分振荡混合，再70℃水浴3 min。再室温放置20 min。然后以14000-18000 rpm 离心2 min，直至上清液澄清。 用400μl的Buffer OW2 充分振荡混合，转移至小离心柱放置于1.5ml微离心管内，以1400018000 rpm 离心1 min；重复此步骤。 再以14000-18000 rpm 空转离心1 min。 将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。把70℃预热的Buffer OEB 75μl加入离心柱中，用移液器吹打3-4下后，即以14000-18000 rpm 离心1 min进行洗脱。为了保证能彻底的洗脱下来，重复此步骤，最后为150μl。（NOTE:多样品时，为保证洗脱效率，可将内置小离心柱的微离心管先置于70℃预热。） 适量电泳检测。另取适量测OD值。 （三）纯化mRNA（每柱量25ug）（Zymo Research RNA clean-up Kit） 每管mRNA样品中加4倍体积的RNA-Binding Buff