ES小鼠嵌合度的微卫星分析研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文粜 ES小鼠嵌合度的微卫星分析 高淑敏，邸科前，温晓辉，李相运‘ (河j￡农业大学动物科技学院，河北省牛羊胚胎王程技术磺究孛心) 摘要目的ES嵌合小鼠是由胚胎干细胞(Esc)和嘲倍体胚胎采用聚合法制备而成。ES小鼠基本 上完全是由ESC发育而来，四倍体胚胎只参与胚外组织的生长，本试验旨在检验四倍体是否参与某 蓥胚体组织的发育。 方法首先制备ES小鼠，再从黼备的22个嵌合体个体内分别采取十三个组 织(血、肺、释、脑、胰、脑、膀、胃、心、睾丸(或帮巢)、牌、肾、肌岗)提取DNA，对六个微 卫星位点进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，观察是否有鹧倍体背景的务带。结果只在五号嵌合体 小鼠肠组织中检测到了参与该组织生长的四倍体胚胎的微卫星位点，这说明ES嵌合小鼠基本上完 全是由胚胎干细胞发育而来。 关键词 Es小鼠四倍体胚胎微卫星分析 ES嵌合小鼠是指用二倍体的胚胎干细胞和四倍体的胚胎细胞聚合所形成的嵌合体。这种嵌合 体在胚胎发育的过程中，圈倍体坯骀来源的细脆在分布上具有一定的倾向性，即倾向予分布在胚外 组织，如胎盘、卵黄囊膜、尿囊膜等；两在胎儿本身的组织中却很少能找到四倍体细胞的成分。在 相关文献已报道的60只四倍体胚胎与二倍体胚胎的嵌合体中，其中55只没有发现四倍体成分，仅 析，在如生的6只ICM--2n嵌会体小鼠中，只有1只小鼠的盘液和尾尖可检测到4n来源的细胞， 且比例少于5％，其余5只均未检测到有4n细胞的存在；在14只ES一4n嵌合体小鼠中，只有3 只小鼠的盘液和琵尖可检溺到4n来源的细胞，但比例都少于lO％t2]。微卫星DNA作为一种分子 遗传标记，其数量多旦均匀地分布在大多数真核及少数原核生物的基因组中，并具有丰富的多态性、 易于检测、保守、等显性遗传等突出优点【3】，但现在还未见报道有采用此法检测嵌合小鼠中的四倍 体成分。本试验选取6个微卫星位点湖，用以分析四倍体细胞是否参与胚体组织的生长发育。其 带篼|j说明四倍体胚胎参与胎儿组织的生长。 1材料与方法 1．1ES小鼠的带0备 l。l。l胚胎子细胞(ESC的分离 0．2ml，隔天2：00腹腔注射PMSG 挑选体重约259的C57BL／6母鼠与下午2：oo腹腔注射HCG 酶短暂消化露用微钱切成小块，重新接种到MEF上，约4天时挑选表面光滑，边缘明显，形状较 圆的集落，继续传代，即分离ESC成功。 1．1．2鸡倍体胚胎(tetraploidembryos)的稍备 腹腔注射PMSG s糯； PulseWidth：50u sec；Repeat：2)。融合后KSOM中培养，使其发育至桑椹胚【67J。 1．i．3聚合胚的制做 ‘ 项嗣基金：国家自然科学基金项目(No和河北农业大学校长基金资助。 通讯作者：李栩运，email：xiangyun_li@yahoo．com．cn 串謇寓教薷医学会动物繁殖学分会第十三麓学零研讨会论文集 挑选长势良好的ESC集落，胰酶消化成合适大小的团块。将融合后的四倍体桑椹胚用链霉蛋白酶 去透明带，然后与ES瀚块共培养，至发育到囊胚[8,9Ao]。 l。l。4胚胎移植 将发育至囊胚的聚合胚移入假孕鼠子宫，使其自然分娩即得到ES小鼠。 1．2ES小鼠DNA的提取 酚提法提取DNA【n]：将22只成年Es小鼠中分别取血、肺、肝、脑、胰、肠、膀、胃、心、皋 吸敬上层本耨，移入另一掰离心管中，加入600ul氯仿：异戊醇(24：1)，充分摇匀，4℃离心， 发现少量絮状沉淀即为DNA；然后用70％酒精洗涤DNA，室温干燥后加入TE溶解，4C保存。 l。3PCR扩增 1．3．1引物 微卫星引物6对，Elj大连宝生物合成，序列觅表l。各小鼠品系对应各位赢的长度觅表2。 1．3．2薹ICR反应体系 总体系(试剂均购期大连宝生物)25ul，包含：10×buffer mol／u1)lul；模板DNA 游引物(10pmol／u1)lul；下游引物(10p