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细胞移植一.细胞移植的基本问题二.细胞移植的应用三.细胞移植的展望一.细胞移植的基本问题1.细胞分离2.细胞植入的主要影响因素3.移植细胞的免疫识别4.细胞保存细胞分离外周血，骨髓——物理方法分离其它多从组织或器官中进行机械，化学或酶学方法分离E.g.：胶原酶分离的细胞（多种类型） 进一步纯化（利用细胞密度，细胞表面属性，细胞表面不同抗原，荧光激活细胞筛选）细胞植入的主要影响因素1）细胞的足量植入2）植入部位的选择，血管的新生以及保证营养和氧气的交换3）局部足够的相关生长因子和免疫调节蛋白4）植入部位的非特异性炎症，免疫细胞释放可溶性的炎症介质（CK NO)——细胞毒作用5）失巢凋亡6）凝集物及补体的局部活化失巢凋亡凝集物及补体的局部活化失巢凋亡的发生是由于细胞凋亡时缺少细胞外基质的相互作用，而常规分离方法易导致大量细胞外基质丢失（e.g.:分离后的胰岛细胞）将细胞移植物输入血流的操作会有效活化补体，产生凝集物移植细胞的免疫识别宿主的免疫排斥反应两种措施：1）免疫抑制2）减少移植细胞的免疫原性：1/利用物理屏障将细胞植入免疫豁免部位2/细胞植入前在体外培养条件下消除组织中的高免疫原性细胞（Ag提呈）；调整改变MHC分子的表达细胞保存组织培养短期保存低温储藏长期培养：1）冻存时加入防冻剂以免形成冰晶2）细胞保存在极低温度下（-196摄氏度—可使细胞的代谢和衰老暂时停止，解冻后可用于移植） 细胞移植 治疗疾病骨髓移植 血液肿瘤：淋巴瘤，AML，CML，MDS干细胞移植 对同一供体其他器官，组织或细胞移植 物耐受的诱导 自身免疫性疾病的预防和治疗胰岛细胞移植1型糖尿病软骨细胞移植 关节软骨缺陷表皮细胞移植 创伤皮肤愈合肝细胞移植 酶缺陷：白蛋白合成，胆红素尿苷二磷酸转移酶成肌细胞和肌细胞移植 肌肉萎缩，心肌梗死神经细胞移植 脊神经损伤，视网膜损伤血管内皮细胞 动静脉修复三.细胞移植的展望——前景传统意义：感染，损伤，中毒，自身免疫 疾病后恢复功能 新的应用：诱导供体的细胞组织实体器官的耐受或用基因工程产生自体细胞，从而用以恢复机体某些功能基因工程的治疗基因治疗是利用载体将目的基因转入靶细胞治疗范围：遗传疾病，传递激素，酶，生物活性物质和局部免疫抑制，以及诱导免疫耐受载体：病毒（逆转录病毒，腺病毒）和脂质体，裸DNA靶细胞：造血干细胞，淋巴细胞，内皮细胞，肌细胞，表皮细胞，成纤维细胞外源性目的基因通过病毒或非病毒来源载体转染给目的细胞，器官或组织，使目的基因表达E.g.：1）复制缺陷的腺病毒载体可以有效地感染不发生细胞分裂的细胞，转染的基因达8kb，并且成功地将基因导入肾脏2）移植前将腺病毒载体灌注供者肾脏器官能够有效地提高传染效率3）病毒蛋白引起的免疫排斥反应限制或去除方法：1/内在性删除腺病毒的部分构建以降低其免疫原性 2/共转染病毒性IL-10抑制对腺病毒抗原的免疫反应 3/阻断共刺激信号（CD28和CD40途径）4）由腺病毒介导的基因转染刺激引起的炎症反应可能使慢性排斥反应过程恶化，并加速异体移植物动脉硬化和裂隙疤痕形成载体 优点 缺点反转录病毒 染色体整合/随即整合 广泛的靶细胞/仅对分裂细胞有效腺病毒 不分裂细胞/非整合，细胞分裂后 丢失 高滴度/免疫排斥，毒性非病毒 简单，无免疫反应/效率低，无整合逆转录病毒载体的构建1.以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的三类结构基因gag，pol，env删除，以供外源基因的插入2.插入的基因一般有： 标记基因——阳性筛选 供治疗用的基因3.包装成含有外源基因的逆转录病毒需要靠包装细胞提供E.g.：PA317，含有一种缺失包装信号的逆转录病毒，只能产生包装所需的结构蛋白，但缺失包装信号，不会被包装成病毒颗粒，可避免产生有复制潜能的逆转录病毒（RCR）腺病毒载体的构建1.目前多采用无致病性的5型及2型腺病毒作为载体2.构建载体时，ITR及包装信号保存，其余的部分有些可删除，供外源基因的插入，插入片段的大小可达8kb脂质体1.定义：主要是由天然磷脂和胆固醇类衍生物组成类似生物膜的脂质双分子层包围水相形成的闭合囊泡2.分类：阳/阴离子脂质体，目前基因治疗所用的脂质体都是阳离子脂质体3.优缺点：介导外源基因转移不受大小限