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欢迎各位专家光临指导 研 究 生 严青春 导 师 熊小亮 副教授 专 业 病理学与病理生理学 研究方向 肿瘤病理 NF-κB抑制剂PDTC对TRAIL诱导人Burkitt淋巴瘤细胞株Raji细胞凋亡的影响 Effect of NF-κB inhibitor PDTC in TRAIL induced Burkitt’s lymphoma Raji cells apoptosis 目录 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 [tumors necrosis factor (TNF)-related apotosis –inducing ligand, TRAIL ]，是新发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员，它能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不影响正常体细胞的生长分化，故而应用重组TRAIL进行肿瘤治疗已引起人们极大的兴趣。 重组TRAIL能诱导多种白血病、肺癌、胃癌等细胞株凋亡，并且呈时间和剂量依赖性。但是后来的研究发现，部分肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡作用并不敏感，且TRAIL重复作用会导致某些敏感细胞对TRAIL产生获得性抗性，这与TRAIL介导的复杂的生物学功能有关。 TRAIL蛋白 TRAIL胞内信号传导 核转录因子κB (nuclear factor-kappa B） NF-κB在TRAIL凋亡信号传导过程中的作用 本课题研究内容 一、细胞培养 Raji细胞，用含l0％ 灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，在常规5％CO2，37℃饱和湿度下培养，3d 传代1 次。取对数生长期细胞用于实验。 二、实验分组 1.细胞对照组 2.TRAIL（100ng/ml）组 3.TRAIL（10ng/ml）组 4.TRAIL（1ng/ml）组 5.TRAIL（1ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组 6.TRAIL（10ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组 7.TRAIL（100ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组 8.PDTC（100μmol/ml）组 三、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同时间不同处理因素作用下Raji细胞的生长情况 四、 TUNEL方法检测不同处理组细胞凋亡 质量控制 阳性结果判定： TUNEL标记后， 凋亡Raji细胞核呈棕黄色。 阴性对照： 不添加TdT酶，其余与实验组步骤完全相同。 HE染色、光镜观察： 凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞 表面有“出芽”现象。 计算凋亡指数(Apoptotic index, AI) ： 数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞和总细胞数， AI（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100% 五、 免疫蛋白印迹 核蛋白提取试剂盒操作示意图 western blotting检测膜蛋白DR4、DR5及核内NF-κB蛋白的表达 计数量资料采用±s表示, 进行方差分析，组间比较用LSD法 Western Blotting图片用Imagetool软件进行灰度值分析,行单因素的方差分析 用SPSS13.0软件对数据进行处理 以P＜0.05有统计学意义, P＜0.01有显著统计学意义 3.1体外培养Raji细胞形态学观 培养12 h后细胞单个呈圆形，透亮，悬浮在细胞培养液中：24 h后，细胞圆形，透亮，悬浮在培养液中，三两个细胞开始出现抱团现像，48 h后，细胞抱团现象普遍。 3.3单用TRAIL及TRAIL联合PDTC对Raji细胞 的诱导凋亡作用 HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 3. 4 western blot检测结果 本实验结果显示 2. PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率 本实验结果显示 100ng/ml，TRAIL能诱导Raji细胞凋亡，但是效果不佳； TRAIL联合PDTC作用后，细胞凋亡指数明显较TRAIL及 PDTC单独用药组高： 与MTT的结果具有一致性。 由此说明：PDTC是通过增强TRAIL的诱导凋亡作用来增加Raji细胞的抑制率。 3. NF-κB在TRAIL诱导Raji细胞凋亡中起负凋节作用 研究表明： TRAIL通过与死亡受体结合诱导细胞凋亡。 在37℃时，TRA