筛选喉癌相关基因lcrg1的有效沉寂序列-中南大学学报医学版.pdfVIP

中南大学学报（医学版） 　２００８，３３（６） ４６８ ＪＣｅｎｔＳｏｕｔｈＵｎｉｖ（ＭｅｄＳｃｉ） 筛选喉癌相关基因ＬＣＲＧ１的有效沉寂序列 １ ２ １ １ １ １ １ １ １ 段朝军 ，蒋铁斌 ，李萃 ，章晓鹏 ，李茂玉 ，肖志强 ，汤参娥 ，易红 ，陈主初 （中南大学　１．湘雅医院卫生部肿瘤蛋白质组学重点实验室，长沙４１０００８； ２．湘雅三医院血液科，长沙４１００１３） ［摘要］　 目的：拟采用 ＲＮＡ干扰技术筛选有效的针对 ＬＣＲＧ１基因的打靶序列。方法：首先采用 ＰＣＲ定点突变技术改造 ｐＳｕｐｅｒ载体，而后利用该改造后的载体构建针对 ＬＣＲＧ１基因的５对打靶序列的 真核表达载体。将构建的重组 ｐＳｕｐｅｒ３６２，３９８，４３２，７８９，９０３表达载体和 ｐＳｕｐｅｒ空白载体分别转染 Ｈｅ ｌａ细胞，经抗性药物筛选获得抗性细胞克隆和池克隆；通过 ＲＴＰＣＲ及荧光定量 ＰＣＲ鉴定阳性克隆，进 行平板克隆集落形成试验，以检测打靶序列沉寂 ＬＣＲＧ１基因ｍＲＮＡ表达水平的效果。结果：应用 ＰＣＲ 定点突变技术改造的ｐＳｕｐｅｒ载体，可被 Ｂｇｌ 酶切；利用 ＲＴＰＣＲ和荧光定量 ＰＣＲ检测各重组载体转染 Ⅱ 细胞池克隆ＬＣＲＧ１ｍＲＮＡ的表达发现，３６２组，３９８组，４３２组的基因均能封闭内源性 ＬＣＲＧ１基因表达， 尤以３６２组为显著；鉴定 ３６２组筛选的各个抗性克隆，发现 Ａ２和 Ａ５克隆的ＬＣＲＧ１ｍＲＮＡ表达水平明 显降低。平板克隆实验结果提示３６２组的Ａ２，Ａ５和池克隆的细胞增殖能力明显强于载体和空白对照 组（Ｐ＜０．０５）。结论：成功改建了ｐＳｕｐｅｒ真核表达载体；３６２ｓｉＲＮＡ相对其他 ｓｉＲＮＡ具有较好的打靶效 果，这对于应用 ＲＮＡｉ方法研究ＬＣＲＧ１基因的功能和其作用分子机制具有重要的指导意义。 ［关键词］　 ＬＣＲＧ１基因；　ＰＣＲ定点突变；　ＲＮＡｉ ［中图分类号］　Ｒ７３９．６　［文献标识码］　Ａ　［文章编号］　１６７２７３４７（２００８）０６０４６８０９ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｈｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｔａｒｇｅｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｌａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅＬＣＲＧ１ １ ２ １ １ ＤＵＡＮＣｈａｏＪｕｎ，ＪＩＡＮＧＴｉｅｂｉｎ，ＬＩＣｕｉ，ＺＨＡＮＧＸｉａｏｐｅｎｇ， １ １ １ １ １ ＬＩＭａｏｙｕ，ＸＩＡＯＺｈｉｑｉａｎｇ，ＴＡＮＧＣａｎｅ，ＹＩＨｏｎｇ，ＣＨＥＮＺｈｕｃｈｕ （１．ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣａｎｃｅｒＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＨｅａｌｔｈｏｆＣｈｉｎａ，ＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ， ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１０００８；２．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨａｍａｔｏｌｏｇｙ，ＴｈｉｒｄＸｉａｎｇｙａＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣｅｎｔｒａｌＳｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ４１００１３，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒ