糖尿病足基因谱表达特征及其对治疗的反应.docVIP

精品论文 参考文献 糖尿病足基因谱表达特征及其对治疗的反应 王安宇 徐寒松 杨传经 赵胜 乔艺杰 （贵阳中医学院第二附属医院代谢内分泌二科 550003） 【摘要】目的：观察糖尿病足基因谱表达特征及其对丹黄散治疗的反应。方法：获取糖尿病足溃疡局部组织，和丹黄散外敷治疗后糖尿病足组织作比较， 以Oligo GEArray.芯片检测两组溃疡组织基因表达谱，比较分析基因表达谱差异。结果：丹黄散治疗组涉及表达上调基因30个，表达下调基因4个。结论：糖尿病足溃疡组织涉及启动基因、效应基因及信号转导基因表达异常，经过丹黄散治疗后，异常表达基因可得以调控。 【关键词】糖尿病足 基因谱 治疗 【中图分类号】R587.2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）05-0022-03 糖尿病足是糖尿病的一个严重并发症，其病程长，病情重，医疗费用巨大，临床疗效较差。目前以改善微循环、抗感染等作为经典治疗方法已使其临床疗效大为提高，但仍有相当高的截肢致残率。糖尿病足属于中医“脱疽”范畴，病机为血瘀毒蕴、痹阻经络，中医外治法以其无创、无痛苦、少污染、低毒副作用等优势逐渐成为中医治疗“脱疽”的一大特色。丹黄散由丹参、大黄等五味中药组成，具有活血、除痹、解毒、生肌之功效，临床疗效显著。为系统研究丹黄散临床疗效，并探讨其作用机制。笔者对丹黄散治疗后的糖尿病足溃疡组织进行基因芯片检测，并和治疗前的糖尿病足组织做对照，以分析其基因表达谱特征，现作报告如下： 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 标本来源 标本取自贵阳中医学院第二附属医院代谢与内分泌科2007年10月-2008年9月糖尿病足患者9例，年龄31—72岁，糖尿病足病史1周-4月，男性6例，女性3例。其中伴发高血压者5例，伴发脂代谢率乱者3例，伴发高尿酸血症/痛风者2例。病例入选后，5例在常规改善微循环和抗感染治疗基础上，予丹黄散外敷治疗；4例则在常规治疗上，予生理盐水、胰岛素、山莨菪碱、庆大霉素浸湿棉纱外敷；本组拟探讨丹黄散作用机制，选择了丹黄散治疗组和分组前糖尿病足溃疡组织作为对照。所获组织分装于不同冷冻管中，液氮速冻。 1.1.2 主要试剂及仪器 Oligo GEArray.芯片由上海康成生物公司提供，标本RNA提取，基因芯片杂交以及图像分析均在上海康成生物公司完成。 1.2 方法 1.2.1 总RNA提取 按Trizol试剂盒说明书进行，经DNaseⅠ消化去除DNA，行两相分离，RNA沉淀，RNA清洗，重新溶解RNA沉淀并保存于-70℃备用。 1.2.2 RNA质量检测 紫外吸收测定法检测RNA纯度和浓度，使用NanoDrop. ND-1000进行操作；变性琼脂糖凝胶电泳检测28S和18S 核糖体RNA带。 1.2.3 cRNA标记与合成 根据TrueLabeling-AMP. 线性RNA扩增试剂盒和SuperArray ArrayGrade cRNA 纯化试剂盒说书进行cDNA 合成；cRNA合成，标记和扩增；cRNA纯化；质量控制。 1.2.4 芯片杂交 1）预杂交，60 deg;C预热GEAhyb杂交液，杂交管放在杂交炉中，以转速5-10 rpm 60 deg;C预杂交1到两小时；2）杂交， 加入4到20mu;g 用TrueLabeling-AMP试剂盒制备的生物素标记的cRNA 样品至0.75 ml预热的GEAhyb杂交液中，混合均匀放于60 deg;C，弃去杂交管中的预杂交液，加入含有标记的cRNA的样品杂交液，于60 deg;C 保持5 到10 rpm旋转杂交过夜；3）洗膜，配制洗液1：2X SSC, 1 % SDS（混合10 ml 20X SSC, 5 ml 20 % SDS, 和85 ml ddH2O）、洗液2： 0.1X SSC, 0.5 % SDS （混合0.5 ml 20X SSC, 2.5 ml 20% SDS和97 ml ddH2O），并预热至60 deg;C。加入5 ml洗液1至杂交管中， 60 deg;C 20 到30 rpm 转动洗膜15分钟，弃去洗液。加入5 ml洗液2至杂交管中，60 deg;C 20 到30 rpm 转动洗膜15分钟，弃去洗液。盖上杂交管盖以保持膜湿润，冷却至室温。 1.2.5 化学发光检测 根据化学发光检测试剂盒Chemiluminescent Detection Kit (SuperArray Bioscience, Catalog Number D-01)操作说明书进行。1）膜封闭：最后一次洗膜后，弃去洗液，立刻加入1.5 m l G