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实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。表 凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特等，2001） 方法 细胞类型 特点 说明 形态学/细胞旋转 不限 简单、快速、低廉、贮存无限制 略带主观性，但可靠 Hoechst染色 不限 极快，不能贮存 略带主观性，但可靠 吖啶橙/溴化乙锭 不限 极快，不能贮存 凋亡初期可用，略带主观性，但可靠 FACS/FSCXSSC 非贴壁细胞 简单，须及时进行 客观，仅能提示凋亡 FACS/PI吸收 非贴壁细胞 简单，需及时进行 客观，不能辨别凋亡于坏死；早期凋亡的细胞呈阴性 膜联蛋白V(锚定蛋白) 最好非贴壁细胞 快速简单；细胞可以被固定 并非所有细胞在膜整合损失前受PS影响；测定已知的显著性 的反应 DNA片段（琼脂糖电泳） 不限 很快、低廉 定性，不能确定凋亡；某些细胞不适用 DNA片段(PI染色) 不限 很快，低廉 定量；用于估计凋亡程度 DNA片段(JAM分析) 循环细胞 低廉，可分析多种类混合 定量，不能确定凋亡含量；不能用于所有细胞 TUNEL 不限 昂贵，耗时 定量，常被认为可靠（尽管应该结合形态学评价） 线粒体膜电位损失 不限 低廉，快速 不能确定凋亡，并非次生坏死前的所有细胞都适用 caspase活化(蛋白酶活性) 不限 中等花费，很快 目前不能确定凋亡，但适用于监测器；不能鉴别特定激活的caspases caspase活化(caspase免疫印迹) 不限 中等花费 可以鉴别特定激活的caspases；依赖于抗体的有效性 caspase活化(基质免疫印迹) 不限 中等花费 通过特异切割反应测定caspase活化；如这些反应功能可确定 形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定：细胞凋亡时，Ca2+、Mg2+依赖的内源性核酸内切酶将双链DNA从各核小体间连接区裂断，产生单或寡核小体，各核小体的DNA与核心组蛋白H2A，H2B，H3，H4形成紧密的复合物而对内源性核酸酶有抵抗使之不被内源性核酸酶裂解。可通过ELISA进行检测，主要使用单克隆抗DNA抗体和抗组蛋白抗体直接检测DNA和组蛋白。该法敏感性高，不需要特殊仪器，可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。 TUNEL法： 细胞凋亡中，染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的黏性3’-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal—deoxynucleotidyl transferase mediated nick