线粒体功能的体外评价方法.docVIP

精品论文 参考文献 线粒体功能的体外评价方法 黄红艳（ 靖江市人民医院柏木分院检验科 江苏泰州 2 1 4 5 0 0 ） 【摘要】线粒体一直被认为是细胞能量生产和代谢工厂，正常的线粒体功能是维持器官的正常功能和细胞稳定的重要因素之一，对于需要高能量代谢的骨骼肌和心肌尤为重要。线粒体相关疾病的形成及其分子生物学诊断需要临床和实验室的检测。线粒体疾病的基因双重性，多器官系统特征以及广泛的可识别表型是目前临床诊断所面临的挑战。为了克服这些临床诊断障碍，实验室对线粒体多方面的评价可以提供相对充足的证据，包括血液学，组织化学分析手段，神经影像分析，刺激实验检测，组织和细胞的酶学分析以及DNA检测(Mancuso M., 2009)。本文就线粒体的功能性评价方法作以下综述，为临床线粒体相关疾病的诊断提供可行的方法学手段。 【关键词】线粒体 呼吸链 功能 评价 【中图分类号】R329 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）01-0130-02 1.活性氧族(Reactive Oxygen Species)的产生在细胞内，线粒体是超氧离子（O2-）和其他活性氧族的主要来源，病理情况下，通过异常的氧化反应，线粒体产生约85%的超氧离子(Boveris and Chance, 1973; Dr?ge, 2002). 在线粒体复合体间的电子转运过程中，约2-5%的离子逃逸并释放O2，导致了O2-在复合体I到复合体I I I中的产生，由于线粒体活性增强或呼吸链的抑制作用，氧离子会显著的增加导致了氧化损伤，这可能是脑神经退行性病变发病的机理之一。活性氧族ROS的生理功能与脑神经元的代谢活性息息相关，过多的ROS会导致线粒体功能异常及神经损伤。例如，在脑缺血和再灌注过程中，细胞间液中过多的ROS会产生氧化应激，氧化平衡被打破，从而导致细胞性的直接或间接的损伤(L e i e t a l.,1998)。因此，检测ROS的产生和分布可以从一方面评价线粒体的功能。 目前有很多R O S 的标记物， 如广泛应用的二氢氯荧光素dichlorodihydrofluorescein (LeBel et al.,1992)，及其各种衍生物如二氢溴乙非啶（Het）(Gallop et al., 1984)，和二氢罗丹明dihydrorhodamine(Duganet al., 1995)。细胞膜渗透型二氢二氯荧光素（H2DCFDA）可通过被动转运进入细胞内，一旦其醋酸基团被细胞内酯分解，就可被氧化成具有荧光的二氯荧光素。二氯荧光素对周围环境氧的水平十分敏感，可进一步被氧化而呈现可见光。其羧化类似物H2D C F能够延长在活细胞内的停留时间(Hempel et al.,1999)。而其另一种具有硫醇反应活性的氯甲基团衍生物能够绑定细胞内的硫醇残基而延长在细胞内的停留时间(Kirkland and Franklin,2001)。这些R O S标记物的不足之处是缺乏对R O S的特异性。目前，一种对氧化还原敏感的重组体绿色荧光素已经被应用，它具有两种不同的最大吸收波长，并且这两种吸收波长彼此间互不干扰(Hanson et al., 2004)，以保证对R OS具有更广更稳定的动力学反应性，并可用于实时监测细胞内的氧化还原状态(Cannon and Remington, 2006)。这些重组荧光蛋白的另一个优点是，它们可以被选择性地针对各种细胞器或结构，如线粒体，细胞核和质膜(Dooley et al., 2004)。 2.线粒体膜电位的检测 线粒体膜电位的产生依赖于线粒体复合物Ⅰ，Ⅲ，和I V呼吸链所产生的线粒体内膜质子梯度。各种各样的荧光团可用于监测线粒体膜电位，最常用的是R h123及其衍生物T M R M. 当R h123能聚集在线粒体内时，能使529n m激发光淬灭，当R h123从线粒体释放进入胞液的时候，能使激发荧光增强(Bahar et al., 2000; Duchen, 1999; Emaus et al., 1986)。 因此，当线粒体膜电位下降的时候，被标记细胞的细胞液荧光将会显著增强。T M R M荧光同样能随着线粒体膜电位的改变而改变。目前的实验表明，R h123的衍生物JC-1对于线粒体膜电位的改变更为敏感,并且在标记JC-1的同时细胞组织的完整性不会被破坏，这也使得JC-1能够应用于免疫组化。值得注意的是，这些细胞膜渗透性染料能够通过所有的脂质体膜，并不仅仅穿过线粒体膜或其他组织，还能穿过质膜，最终染料将大量堆积在线粒体基质(K e r r D S. 2010)。这些淬灭模式检测线粒体的荧光是一种非线性的，因此无法准确量化单个细胞中线粒体膜电位的变化，很难比较