细胞色素P4503A代谢模型的研究进展.docVIP

精品论文 参考文献 细胞色素P4503A代谢模型的研究进展 王丽萍（云南省通海县人民医院 云南通海 652700） 【中图分类号】R963 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2010）28-0181-02【摘要】细胞色素P450（CYPs）是一组结构和功能相关的超家族基因编码的同工酶，负责内源性底物、外源性物质和许多其他合成性化学物质的代谢。CYP3A亚家族成员因为其含量最多、底物谱大，是药物代谢反应中最主要的限速酶。本文综述了近年来CYP3A的代谢模型的研究进展。 【关键词】细胞色素P450（CYPs） 代谢模型 细胞培养 CYP3A是细胞色素P450亚家族成员，是药物代谢反应中最主要的限速酶。目前，研究CYP3A的代谢模型得到了快速的发展，本文就近年来CYP3A的代谢模型研究进展作一综述。 1 人的肝、肠亚细胞成分 新鲜肝组织匀浆经高速离心除去细胞核、线粒体及未破碎组织碎片等，上清液再经超速离心得到的沉淀即为微粒体成分，用适当缓冲液悬浮后即可用于代谢研究。 2 人的肝细胞及肝癌细胞或肠细胞及肠癌培养物 肝细胞培养适合于组织的获取极为有限的情况，该方法保持了完整细胞的功能，与正常生理状况接近，与体内有一定相关性。肝细胞体外孵育法可用于研究药物代谢、药物跨膜转运、细胞毒性和酶诱导研究。 Caco-2来源于人结肠腺癌细胞，此种细胞可以模拟小肠上皮细胞，广泛用于药物吸收过程中物理和生化屏障的研究及药物代谢研究。 3 离体肝或肠灌流法表达系统在能获得整个新鲜肝或肠组织的情况下，采用离体灌流法。定时采集灌流液，测定药物及其代谢物的浓度。离体灌流法具有器官水平优势，兼备体外实验和整体实验的优点，适用于定量研究药物的体外代谢行为，并能解决在其它的体外代谢模型和整体动物实验中不能得到满意解决的难题。 4 肝组织切片法 肝组织切片法是将新鲜肝组织先用打孔机制成肝条，再用切片机切成一定厚度（250~300mu;m）的切片，实验时将肝切片与药物同时孵化。该方法保留了细胞间的联系及一定的细胞间质，更能反映药物在体内生理情况的实际代谢过程，且可在较长的孵育时间内保持代谢活性。 5 细胞色素P4503A的异源表达系统 5.1 细菌表达系统 大肠杆菌常用于P450的表达。它的优点是：①表达水平高；②容易操作；③有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供使用。其缺点是在大多数情况下，在cDNA表达以前，先要经修饰。通过切除CYP3A4的NH2端第3-12氨基酸，表达在载体（pCWOrit）DH5alpha;细胞上，CYP3A4的产量达370nmoLmiddot;L -1。张宝一等成功地使 CYP3A4基因在大肠杆菌中高效表达[1]。 5.2 酵母表达系统 选择酵母用于人P450的异源表达系统具有许多优点：①操作简单；②无需cDNA修饰，可得到高产量的CYP稳定酶；③在酵母中存在内质网。但酵母的P450还原酶可能在量上不足，因此可能不能支持最大的催化活性，需加入外源P450还原酶于微粒体制备溶液中。 5.3 哺乳动物细胞表达系统 5.3.1 COS细胞 为在COS细胞中产生有活性的P450，cDNA必须克隆到表达载体上，将构建的DNA 转染进COS-1或COS-7细胞中，DNA在细胞中复制2-3天后，收集细胞用于活性测定。COS细胞系统简单，应用较广。 5.3.2 痘苗病毒 痘苗病毒也已被用于表达一些大鼠和人的P450。痘苗表达系统不需要修饰cDNA，因为5prime;和3prime;非翻译区不影响表达水平。痘苗病毒是裂解病毒，可以杀死细胞，因此在侵染1-3天内要收获细胞。重组体痘苗病毒在药物代谢研究中特别有用。 5.4 昆虫细胞表达系统 杆状病毒仅限于侵染昆虫细胞。CYP3A4在杆状病毒中表达，表达的P450与P450还原酶重组酶系，表现出一定的催化活性。 5.5 稳定表达系统 B淋巴母细胞可以表达人的P450。B淋巴母细胞AHH-1+/-支持包含Epstein-Barr病毒复制起点的染色体外载体的复制。AHH-1细胞含有足够的P450还原酶和细胞色素b5，支持P450的催化活性。P450 cDNA插入到包含可选择标记的质粒载体中，产生对潮霉素B的抗性，或在1-组氨醇中可以生长。用潮霉素B和1-组氨醇选择每细胞分别产生5和40个附加型拷贝数，能提高表达水平。在某些情况下，与P450还原