实验 Folin-吴.docVIP

实验 Folin-Wu法定量测定血糖的含量 一、目的 1、掌握Folin－Wu法测定血糖含量的原理和方法。 2、学会制备无蛋白血滤液。 3、掌握7200型可见分光光度计的使用方法。 二、原理 葡萄糖是一种多羟基的醛类化合物。其醛基具有还原性，与碱性铜试剂混合加热，葡萄糖分子中的醛基被氧化成羧基,Cu2+即被葡萄糖还原成Cu+（Cu2O）而沉淀。 无蛋白血滤液中的葡萄糖和碱性硫酸铜溶液共热反应, Cu2O又把酸性钼酸试剂（Mo6+）还原成低价的蓝色钼化合物—钼蓝 。 血滤液中葡萄糖的含量与产生的Cu2O成正比，而Cu2O的量与产生的钼化合物的量成正比。可用比色法定量的测定。 三、实验仪器 1、25mL血糖管×3支； 2、血糖管橡胶塞×3个； 3、1mL胖肚吸管×1支； 4、100mL锥形瓶×2个； 5、漏斗架×1个； 6、普通漏斗×2个； 7、水浴锅×1个； 8、电炉×1个； 9、移液管 1mL×2支; 2mL×3支;5 mL×2支;10 mL×1支; 10、滤纸×1盒； 11、吸耳球×2个； 12、7200型分光光度计×1台; 13、表面皿×1个 四、实验试剂 1、标准葡萄糖溶液（0.1mg/ml） (1)1%葡萄糖母液：称取1.000g葡萄糖，溶于蒸馏水，稀释并定容至100ml。 (2)葡萄糖标准液：取1.0ml葡萄糖母液于100ml容量瓶中，加蒸馏水定容。 2、10%钨酸钠溶液：称取钨酸钠10g，溶于蒸馏水并定容至100毫升。 3、0.33mol/LH2SO4溶液：于53ml蒸馏水中加入1ml的浓硫酸。 4、碱性硫酸铜溶液 A液：无水碳酸钠35g，酒石酸钠13g及碳酸氢钠11g溶于蒸馏水，稀释定容至1000ml. B液：硫酸铜晶体5g，溶于蒸馏水并定容至100ml。 临用时，A液：B液=9：1混合（体积比），混合液于冰箱中保存（4℃）。 5、酸性钼酸盐溶液： 称取钼酸钠600g,用少量蒸馏水溶解后倾入2000ml 的容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，倾入另一较大的试剂瓶中，加溴水0.5ml，摇匀，静止数小时后取上清夜500ml，于1000ml容量瓶中，徐徐加入225ml85%磷酸，边加边摇匀，再加25%硫酸150ml。 置暗处次日，用空气将剩余的溴赶去。然后加99%醋酸75ml，摇匀，用蒸馏水稀释定容至1000ml,贮于棕色瓶中。 五、实验步骤 1、无蛋白血滤液的制备： 用奥氏吸管吸取全血（已加抗凝剂）1ml,缓缓放入100ml锥形瓶中，加蒸馏水7ml，摇匀，溶血后（血液变为红色透明）加10%钨酸钠1ml，摇匀.。 再加0.33mol/L H2SO41ml，边加边摇，加毕充分摇匀，放置5～15分钟，至沉淀变为暗棕色（如不变色可再加0.33mol/L H2SO41-2滴）。 用干滤纸过滤。先倾入少许，待滤纸湿润后在全部倒入，如滤液不清需重新过滤。每毫升无蛋白血滤液相当于1/10ml全血。 2、血糖的定量测定： 取25ml的血糖管3支，编号。第一支血糖管中加入2ml蒸馏水（空白管）；第二支血糖管中加2ml标准葡萄糖液；用吸管吸取无蛋白血滤液2ml，放入第三支血糖管中。 然后向三支血糖管中各加入2ml新配制的碱性硫酸铜溶液，同时置于沸水浴中8分钟，取出，在流水中迅速冷却后,勿摇动，各加4ml酸性钼酸盐溶液。 一分钟后，用蒸馏水稀释至25ml，混匀，用7200分光光度计在420nm波长处比色，以空白管调节零点。 六、实验结果 测量次数/试剂编号 1 2 3 1 0．000 0.076 0.148 2 0．000 0.076 0.148 3 0．000 0.076 0.148 根据公式m=A1*C0/A0*1000 得全血中所含血糖质量为0.01947mg/ml 七、实验分析 实验过程中那些操作可能影响实验结果的准确性？ 答： 1所取血液的量必需精确.假如由吸管中放出血液的速度太快,会有大量血液粘在吸管内壁,容量不准,所以普通放出1ml血液所用的时间不应少于1min. 2.沉淀由鲜红变为暗棕色,是因钨酸钠与硫酸作用生成钨酸,在恰当酸度时,使血红蛋白变性,沉淀.如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊,可在钨酸与血混合液中参加10%硫酸1～2滴,待变为暗棕色后再滤. 3．加硫酸、钨酸钠时，要边加边摇匀,使硫酸和钨酸钠充沛反响，从而完整沉淀蛋白质。4.用定量滤纸过滤后应该得到完整廓清无色之无蛋白血滤液。 假如得到仍带有红色的血滤液则阐明蛋白质未被完整去除。5. 过滤时应于漏斗上盖一外表皿，避免水分蒸发。6.热水浴必需严厉控制在八分钟，然后用流水冷却，但制止摇动试管。7.混匀的时分用大拇指抵住试管口，旋转试管一百八十度，重复若干次。8.所用试