第九章 标记-2.ppt

第三节 核素标记 标记核酸的核素有32P、33P、35S、3H等； 以 [α 32p]－dNTP为标记物 3.1 双链DNA探针 3.1.1切口平移法 原理：同前（DIG-II-dUTP） 3.1.2 随机引物介导法（延伸法） 原理：同DIG-II-dUTP 试剂： ?模板：变性的闭环DNA或线性DNA ?随机引物：可购买或自制 ?前体：dNTP，其中一种为α －32p标记 ? DNA聚合酶：可用E.coli DNA聚合酶I的klenow大片段 第四节 探针的纯化 探针被用于原位杂交时，必须进行纯化，以除去未标记的同位素或非同位素。 常用的纯化方法包括： ?萃取/沉淀法： ?层析法： ?离心法： ?电泳法：鉴定 4.1 乙醇沉淀法 原理：DNA或RNA可被乙醇沉淀，而未掺入的小分子dNTP保留于上清液中,反复乙醇沉淀，可分离之。 4.2 层析法 4.2.1 Sepharose CL－4B柱层析 用于快速分离核苷酸探针（150bp） 4.2.2 Sephadex G－50或G－25柱层析 排阻极限： G－25柱：10-12bp G－50柱：72bp 旋转色谱柱： ?原理： 离心与过滤法结合， 可快速去除小分子未标记物（包括：核素、非核素，NTP、缓冲离子） ?操作： 装柱→离心（去除柱中缓冲液）→上样→离心（收集DNA/RNA）→洗脱 第五节 探针的鉴定 探针鉴定的内容： 长度测定 示踪物的掺入率 测定方法： 杂交法 酸沉淀法 层析法 5.1 杂交法 步骤： 1）印迹： ?将靶核酸溶于TE缓冲液中，点样于NC膜或尼龙膜上； ? 或Southern/Northern印迹：将靶核酸点样于琼脂糖凝胶上，电泳→ 印迹转移至NC膜上； 固定核酸：80℃ 烘箱 ，0.5－2hr 2） 杂交：将探针与NC膜上的靶核酸杂交 方法：见《生化实验方法和技术》p317 3）检测： 化学发光法 酶联免疫法 放射自显影系统（核素） 印迹术： Southern blot：1975年，Southern 发明DNA印迹术； Northern blot：1977年，RNA印迹术； Western blot：1979年，蛋白质印迹术； Eastern blot：双向蛋白质印迹术。 5.2 酸沉淀法 原理： 大于20个核苷酸长度的DNA或RNA分子，在强酸溶液中能被定量沉淀出来，前体小分子dNTP /NTP被留溶液中。 ?用第二张滤膜收集沉淀（洗涤试管，重复4次，收集）→ 用3ml乙醇洗涤（去除前体小分子）； ?二张滤膜浸入含甲苯的闪烁液中，用闪烁计数仪测放射强度。 第一张为X1(总放射强度），第二张为X2（标记放射强度） 第六节 蛋白质（酶、抗体）标记 蛋白质的标记可采用： ?酶 ?荧光染料 ?生物素 ?有色金属试剂 6.1 酶标记 用于标记抗体的酶有： ?辣根过氧化酶（HRP） ?碱性磷酸酶（AKP） ?半乳糖苷酶 由抗体－酶制成偶联体（特异性探针），应用十分广泛。 6.1.1 辣根过氧化酶（horse radish peroxidase）HRP HRP： ?植物中研究最透彻的一种过氧化物酶； 偶联方法： 1)过碘酸盐法： 2) 戊二醛法： 6.1.2 碱性磷酸酶（AKP） 一步法： 由戊二醛偶联AKP与IgG 6.1.3 半乳糖苷酶 ?戊二醛法 ?间位－马来酰亚胺苯－N－羟基琥珀酰亚胺酯（MBS） 连接IgG中游离氨基与蛋白质中的半胱氨酸 6.2 荧光染料标记（制备方法不作要求） 常用的荧光染料有： 荧光素（fluorescien） 罗丹明（rhodamine） 德克萨斯红（texas red） 藻红朊（rphycoerythrin，PE） 四甲基罗丹明（tetramethyl rhodamine） 6.3 生物素标记 原理： 蛋白质与小分子生物素偶联后，不会改变其活性。 1）生物素标记抗体： 用生物素琥珀酰亚胺酯（可购买）→ 标记 2）生物素标记蛋白质： ?生物素－羟基琥珀酰亚胺（BNHS）： ?生物素马来酰亚胺： ?生物素肼： 6.4 金标记 原理：金粒与抗体偶联，在电镜下观察胶体金颗粒（根据金粒的电子密度特征） 6.5 核素标记 1）32P正磷酸盐 2）[r 32P] 或〔r 33P〕－ATP： 通过蛋白质的磷酸化来标记 3）3H，14C，125I：标记底物 探针信号的检测： 酶法检测； 荧光检测； 化学发光检测 本章小结： 核酸探针标记 非核素标记（DIG、生物素） 核素标记（32P） 探针的纯化 探针的鉴定 蛋白质（酶、抗体）标记 核酸探针标记（DIG标记）： ?双链DNA探针的标记： ?随机引