目的基因在原核细胞中的表达.docVIP

实验八? 目的基因在原核细胞中的表达 ? 一、实验原理 （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ????? 简称为PAGE（Polyacrylamide gel electrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和N,N-亚甲基双丙烯酰氨聚合而成，这一聚合过程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有两种：化学聚合和光聚合。化学聚合通常是加入催化剂过硫酸铵（AP）以及加速剂四甲基乙二胺（TEMED），四甲基乙二胺催化过硫酸铵产生自由基。? 聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。 （二）诱导表达原理 ????? IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。 ? 二、实验用品 1.仪器用具：垂直电泳槽、电泳仪、eppendorf管、微量移液器、枪头、微量加样器、25ml烧杯、直径20cm培养皿、量筒、容量瓶、试剂瓶、单面刀片、蛋白Marker； 2.材料试剂：含目的基因表达载体的M15菌株，Amp， Kana，LB液体培养基，SDS、丙烯酰胺、N,N-亚甲基双丙烯酰氨、Tris、甘氨酸、HCl、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、甘油、溴酚蓝、甲醇、乙酸、NaOH。 3.需配试剂 （1）4×Tris.Cl/SDS pH8.8 ???? 300mlH2O中溶解91gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH8.8，补加H2O至整体积为500ml，加入2g SDS，可4℃保存一个月。 （2）8×Tris.Cl/SDS pH6.8 40mlH2O中加入6.05gTris碱，用1mol/L HCl调校至pH6.8，补加H2O至整体积为100ml，加入0.4g SDS， 4℃保存。 （3）2×SDS 加样缓冲液 25ml????????????? 4×Tris.Cl/SDS pH8.8 20ml???? ?????????甘油 4g??????????????? SDS 200mg???????????? 溴酚蓝 加H2O至100ml，混匀 （4）SDS电泳缓冲液?? 5× 15.1g???????? Tris碱 72.0g???????? 甘氨酸 5.0g????????? SDS 加水至1000ml,用前稀释至1×SDS电泳缓冲液 （5）10%过硫酸铵（AP）(现用现配) 10g过硫酸铵，加水至100ml （6）30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨 丙烯酰胺??????? 29g 甲双丙稀酰氨?? ?1g H2O????????????? 100ml 避光4℃保存 （7）考马斯亮蓝染色液 50%（v/v）甲醇 0.05%（v/v）考马斯亮蓝R-250(Biorad 或 Pierce) 10%（v/v）乙酸 40% 水 用去离子水配制 在加乙酸和水之前应将考马斯亮蓝R-250溶于甲醇。溶液可保存6个月。 （8）脱色液 ? 7%（v/v）乙酸 5%（v/v）甲醇 88%水 ? 4.聚丙烯酰胺分离胶与积层胶制备 分离胶 贮液 分离胶中丙烯酰胺的终浓度（%）（ml） 5 6 7 7.5 8 9 10 12 13 15 30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨 2.50 3.00 3.50 3.75 4.00 4.50 5.00 6.00 6.50 7.50 4×Tris.Cl/SDS pH8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 H2O 8.75 8.25 7.75 7.50 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75 10%过硫酸铵 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 四甲基乙二胺（TEMED） 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 （1）分离胶的制备（15ml） ? 25ml烧杯中，混匀7.50ml 30%聚丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙稀酰氨，3.75ml pH8.8的4×Tris.Cl/SDS缓冲液和3.75ml水，加入过硫酸铵50ul和TEMED 10ul，摇