携带口蹄疫病毒P12A基因gIgELacZ伪狂犬病毒转移载体构建研究.pdfVIP

192 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 携带口蹄疫病毒P1—2A基因gI-／gE／LacZ+ 伪狂犬病毒转移载体构建 2 史秋梅”向华1王凤霞。2宣华1 (I．广东省农业科学院兽医研究所，广东广十H510640；2．吉林大学农学部动物医学院，吉林长春130062) 抽要：采用PCR扩增连接的方法将LacZ基因、口蹄疫病毒结构蛋白基因P1-2A基因按正确的读码框依 建转移载体plESZ。然后，将FMDV衣壳蛋白基因P1—2A插入转移载体plESZBamHI位点，构建携带FMDV免 疫原基因的重组伪在犬病毒转移载体plESZ—PI。重组转移载体经测序鉴定。舍有完整的目的基因表达盒。构 建的转移载体质粒为与伪征犬病毒(PRV)进行细胞内同源重组产生FMDV与PRV的重组病毒打下了基础。 关健词：口蹄疫病毒，伪狂犬病毒，转移载体 口蹄疫(FMD)和伪狂犬病(PR)是严重危害全球养猪业的两大重要传染病，分别由口蹄疫病毒 (FMDV)和伪狂犬病病毒fPRV)；【起。口蹄疫是人畜共患的急性、烈性传染病，由于其传染性极强，而 传统的灭活疫苗在生产使用过程中有灭活不彻底导致病毒逃逸工厂而发生口蹄疫的风险，因此口蹄疫 基因工程疫苗的研究受到高度重视。而PRV则主要引起猪繁殖障碍性疾病，随着我国养猪业规模化发 展，猪伪狂犬病有流行蔓延趋势，给养猪业带来巨大损失。 此之外，T细胞抗原表位也存在于不同的结构蛋白上。相对于VPl来说，Pl存在更充分的B、T细胞 表位，因此，衣壳蛋白前体PI一2A要比VPl更具有作为免疫原基因的优势。目前人们的焦点主要集中 在利用FMDV结构蛋白基因，以表达m病毒的空衣壳，从而期望产生与自然病毒相似的免疫保护作用。 以病毒表达载体为基础的基因工程载体疫苗是当前病毒防制研究的重要方向，以伪狂犬病病毒基因缺 失株为表达载体具有基因组容量大、安全『生高、稳定性好等优点，已有十多种外源基因在PRV中得到 成功表达。将其它病原的保护性抗原基因插入PRV基因缺失载体中，就可构建成二价基因工程疫苗， 可以一针防两病。 重组转移载体pIESZPl。为构建FMDVPI基因与PRV的重组病毒打下了基础。 1材料与方法 1 1质粒、载体与宿主菌 载体由本室构建。 1．2引物及扩增 段2318bp；产物电泳与回收纯化。 1．3连接与转化 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 193 质粒、鉴定、测序。 1．4 gl-／gE一(PRY)基因缺失plESneo重组载体筛选标记的改造 1．4．1 1．4．2质粒pMDIacZ的双酶切及修饰：用SmaI和XbaI双酶切，回收含lacZ基因片段。 1．4．3连接：pIES片段与lacZ基因按粘端平端进行连接。 1．4．4转化：连接产物转化至JMIIY)大肠杆菌感受态细胞中。 1．4．5重组质粒鉴定：采用快速鉴定粗筛可疑菌落，再经smaI和XbM酶切箍定重组质粒的大小。再 转移载体，命名为pIESZ。 1．5 o piESZPI 1．6含P1基因重组转移载体plESZPl的鉴定 、 1．6．1 PCR鉴定：以重组转移载体piESZ 琼脂糖电泳。观察扩增片段大小。 PST 1．6．2 I酶切鉴定：以PST piESZ正向连接的质粒。 1．6，3Xho I酶切鉴定：以Xho PI，1％琼脂糖电泳后，进一步验 I酶切正向连接重组转移载体pIESZ 证插入的目的基因P1方向正确性。 构建策略图： 2结果 2．1 LaeZ及目的基因P1的扩增 处出现一亮度很高的特异条带，大小与预期相符。 194 中国微生物学会兽医微生物学专业委员会2006年学术研讨会论文集 图lLacz基因的扩增 1,2．3．Lacz基因PCR产物 图2目的基因P1的 4DNAMarkerk-Hi