弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达研究.pdf

科技创新 开拓未来一005年湖南师范大学第一届青年科技论坛 弓形虫GRA8真核表达质粒的构建与体外表达 袁仕善 吴少庭黄达娜 张仁利 高世同 (湖南师范大学医学院) 摘要 目的：构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA8的真核重组表达质粒。方法：设计GRA8的特异引物， 扩增出GRA8基因的特异片段，所获克隆的序列正确，并被亚克隆到真核表达载体pVAC，构建了真核重组表 GRA8。 关键词 弓形虫；致密颗粒蛋白；GRA8；表达；RT—PcR 弓形虫是一种分布广泛的、专性细胞内寄生的机会致病性原虫，可感染人及多种动物的有 核细胞。估计全球有5一10亿人受感染，我国弓形虫感染人群至少也有6千万，所幸多数为隐 性感染…。弓形虫感染人体后可侵犯多种脏器和组织，并可通过母婴垂直传播而造成胎儿畸 形、神经系统发育障碍、脉络膜视网膜炎等，引起流产、早产甚至死胎；对免疫功能低下及艾滋 病患者常是致死的主要病因。弓形虫病已成为一个世界性的公共卫生问题，引起了医学界和 兽医学界的高度重视。研制弓形虫疫苗，对有效控制弓形虫感染、提高人口素质具重要意义。 本文利用真核表达载体pVAC构建GRA8的真核重组表达质粒，并分析其在体外的表达，以期 为弓形虫GRA8的重组真核表达质粒用于体内DNA疫苗的研究奠定基础。 l材料与方法 l，l 虫株、菌株、质粒和细胞 coil coli Biosciences公 弓形虫RH株、E DItSa由本室保种。EJMl09购自瑞典Amersham E6细 胞株由深圳市疾病预防控制中心微生物检验科程小雯副主任技师赠送。 I．2仪器与试剂 9700型PCR仪系美国Applied DNA聚合 生产；核酸蛋白定量仪系AmershamBiosciences公司生产。标准分子量DNA、Taq 酶、pMDl8一T载体、DNA酶I、14DNA连接酶、DNA的胶回收纯化试剂盒、RNA抽提试剂盒、 I和EcoRI系 一步法RT—PCR试剂盒购自大连宝生物工程公司；限制性核酸内切酶BamH 2日2 keji 霪r一_“婿～，4椭～和一一辨e chuan9xin 立陶宛MBI 物工程公司；标准分子量预染蛋白质购自美国NewEngland 公司；NC膜购自美国Bio—Rad公司；DMEM培养基、RPMI Invitrogen公司；小牛血清、胎牛血清购自美国HyClone公司，其他试剂系国产分析纯。 1．3 弓形虫速殖子基因组DNA的提取 弓形虫速殖子感染健康小鼠3天后，从小鼠腹水中收集弓形虫速殖子，PBS洗涤，重悬于 mmol／L mmol／L mmol／L 8．0的10 riffs—HCI、1 EDTA、0．15 0．2mL含l％SDS的STE(pH NaCl)液中，补加蛋白酶K至0．1mg／mL，37oC消化过夜；用等体积的饱和酚、饱和酚／氯仿、氯 仿各抽提一次，无水乙醇沉淀DNA，溶于TE中，一20℃冻存备用。 1．4 GRA8基因的体外扩增和克隆 min；94oC变性45sec，65oC退火45 组DNA为模板，扩增反应条件为：94℃预变性5 sec，72℃ 延伸lmin，共35个循环；72℃延伸7min。1％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物。切胶回收，与 T载体pMDl8一T于16℃连接6h，转化大肠杆菌JMl09感受态细胞，涂板，菌落PCR和质粒 DNA序列分析鉴定阳性菌株。