HPV1611型L1基因双价重组杆状病毒株的构建、表达及免疫学的实验研讨.pdfVIP

哈力.xs 医料大学俘d二举位 论文 摘 要 目的 人乳头瘤病毒 (Humanpapillomavirus,HPV)是引起人类皮肤和粘膜的乳 头状瘤或统，并可导致恶性转化的病毒。研究表明，40%以上的宫颈癌发生与人乳 头瘤病毒的感染有关，其中50%左右的宫颈癌由高危型别BPV16型感染引起。尖 锐湿庆是目前流行的性传播疾病之一，主要由低危型别HPVll或6型感染引起。 同时，HPV具有型别特异性，各型别之间无明显交叉保护，所以研制HPV基因工 - 程多价疫苗是预防HPV感染的最佳途径。 本研究从尖锐湿洗组织中克隆了HPVllL1基因，利用原核细胞表达HPVIILI 主要衣壳蛋白，并将本地区流行株HPV16L1基因与HPV11L1基因双表达于杆状病 毒昆虫细胞表达系统，为研制同时预防宫颈癌和尖锐湿统等多种疾病的HPV16-11 型基因工程疫苗奠定基础。 方法 提取尖锐湿虎组织DNA，用感染常见的8型的特异引物进行 PCR法筛选尖锐湿疵组织中感染的HPV11型DNA，并分析各型别之间的比例。进 一步将4例标本中HPV11型Ll基因进行克隆，构建克隆质粒pSP73-HPV11L1,测 序分析其基因变异。将HPVll型L1本地株酶切后连接到原核表达质粒pBAD/B, ‘ 构建原核表达系统pBAD-HPVIILI/Top10，经酶切鉴定重组质粒的正确性。经L- Arobinose诱导后表达HPVll型L1蛋白，利用SDS和Westernblot对表达产 物进行鉴定。同时，对本地流行株HPV16L1基因进行亚克隆，构建pBluescript- HPV16L1克隆质粒，并对其AJ序。测序结果正确后，酶切HPV16L1，连接到 pFastBacDual的强启动子phol后:从克隆质粒pSP73-HPVllL1切下HPVllLl，连 接到pFastBacDual的弱启动子p10后，利用BactoBac系统在昆虫细胞Sf9中表达 外源蛋白。SDS和Westernblot鉴定HPV16Ll和nPV11L1蛋白的表达量及 特异性，电镜证实昆虫细胞内有较大量的VLP的形成。将表达有外源蛋白的昆虫细 胞收集，经超速离心后，收集1.29g/cm的区带，透析后定量。将VLF免疫BALB/c. 小鼠3次，末次免疫后，取血清检测其抗HPV16L1和HPV11L1的抗体水平。 结果 PCR法鉴定尖锐湿统组织中HPV的感染率为100%，其中6型与11型感 染例数一致，16型感染也少量存在，18型感染未检测出。HPV11L1开放读码框 哈尔淇 医科 大学 1习d:学位 i仑j忆 PCR扩增产物片段大小为1.5kb，与预期结果相同。重组质粒pSP73-HPVIILI克隆 片段11L1基因测序后，与原始序列相比有两处点突变，分别为:C25ST和 C837T，均为氨基酸第三位密码子，是同义突变口经酶切证实原核表达质粒pBAD -HPVIILI构建成功。重组工程菌诱导后，表达的蛋白经SDS和Western blot分析，相对分子量在58KD处有特异蛋白带。酶切和PCR法证实pFastBacDual -HPV16L1-HPVIILI转移质粒连接正确，转化到DH10Bac后转座成功，形成了重 组的Bacmid/HPV16-HPV11L1。将重组的Bacmid转染昆虫细胞SI9后，检测到 HPV16和HPVIILI特异蛋白，两种蛋白的相对分子量相近，约56KD。电镜观察 到了类病毒颗粒 (Viruslikeparticles,VLP)的大量存在。超速离心后提取的VLP免 疫小鼠的血清出现与原核表达产物HPV16L1和HPV11Ll蛋白反应的特异蛋白带。 结论 本研究首次成功地克隆了本地区尖锐湿庆组织中HPV11型Ll基因，并利 用BactoBac系统构建重组病毒Bacmid/HPV16-HPV11L1。转染到Sfl3昆虫细胞后 重组外源蛋白得到高效表达，并经电镜证实昆虫细胞内存在较大量VLP。超速离心 后的VLP免疫小鼠后，小鼠可获得抗16型和11型Ll两种蛋白的血清抗体。为进 一步制备基因工程多价疫苗奠定基础。 关键词:人乳头瘤病毒16型 人乳头瘤病毒i1型 Ll基因 双表达 杆状病毒 免疫 哈力屯习年医科 大学俘 d匕李 位 1仑大 CoexpressionofHPV16and1