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卡拉胶裂解酶研究进展Advances on Carrageenase Research 院 系： 　药学院 专 业： 专升本药学 姓 名： 　贾云莉 指导老师： 武玉永（讲师） 目录 1、卡拉胶酶的分类及来源 2、卡拉胶酶的性质 3、卡拉胶酶新研究 4、卡拉胶酶活性研究 5、卡拉胶酶的分子生物学研究 6、分子生物学研究 7、展望 1 卡拉胶酶的分类及来源 1.1 卡拉胶酶的分类 根据酶解底物的专一性质，可分为κ-卡拉胶酶，ι-卡胶酶，λ-卡拉胶酶等。卡拉胶是由1，3．B．D．吡喃半乳糖和l，4-0．D．吡喃半乳糖交替连接而成的线性硫酸多糖，日前所发现的卡拉胶酶大多数是 κ-卡拉胶酶，只有2种 ι-卡拉胶酶和1种κ-卡拉胶酶。 1.2 卡拉胶酶主要来源 较多的来源于微生物和海洋动物。微生物来源的卡拉胶酶, 目前已从假交替单胞菌属 噬纤维菌属、交替单胞菌属(Alteromonas carrageenovora) 弧菌(VibfioZo – belliagala ctanovorans)和假单胞菌属(Pseudo monas Carageeno vora)等中发现卡拉胶酶，部分报道表明，海洋软体动物也能分泌卡拉胶酶，Mori(1943)曾用海洋软体动物中的水解酶(其中有卡拉胶酶)处理皱渡角叉菜(Chondrus crispus)提取多糖。 2 卡拉胶酶的性质 2.1 酶学性质 用硫酸铵沉淀，离子交换色谱，凝胶过滤色谱(G-200)纯化得到 κ卡拉胞酶，纯化的酶分子量用SDS／PAGE电泳测定为100000， 卡拉胶酶的最适pH为7．6，最适温度为25℃ 。金属离子对Cytophaga，lk-C783生长的影响，NaC1和MgCl2可被细菌利用，2216E中培养基最小浓度0.05mol／L NaC1，0．25MgC12[7]。 KC1和CaC12对产酶没有作用，当营养物质充足的时候，卡拉胶酶在休眠和生长的细胞都可合成和释放。 2.2 作用机制 根据水解过程异头碳的构象是否发生改变，可将糖苷水解酶的作用机理分为保持型和倒置型[9]。1995年，Potin等人说明了κ-卡拉胶酶是以保持异构构型的分子机制进行水解的，且目前已经发现的GH-16家族的糖苷水解酶作用机制均为保持型[10]同时，对ι卡拉胶酶进行研究，发现它是通过异构构型全部转换的方式降解 ι-卡拉胶，使其内部的β-(1-4)连接断裂。2007年，Guibet等人通过核磁共振氢谱分析，说明car-rageenovora -卡拉胶酶的作用方式也是转换型的分子机制[11]。 3 卡拉酶新研究 3.1 卡拉胶酶的结构研究 通过x一射线衍射和多波长不规则衍射(MAD)技术，发现它折叠成一个弯曲的β-三明治，球状结构几乎全部由β一折叠和表面loop组成，其中每一个β一折叠片层由6或7个β链组成，2000年Michel等又对A．fortis L一卡拉胶酶的晶体结构进行了分析 ，该酶折叠成右手平行的β一螺旋结构，由10个完整的转角和表面loop组成；核心是三个平行的β一折叠片组成，其中一个折叠片嵌于另外两个平面彼此垂直的折叠片形成的凹槽。研究认为，在前者上有寡糖存在，推测这个凹槽很有可能就是 底物的结合位点。和其他大部分β一螺旋蛋白一样，ι-卡拉胶酶在N一末端区域存在一个两亲性α-螺旋；不同的是，其C一末端区域是高度复杂的，是运用了一种α/β折叠形式。 3.2 卡拉胶酶降解作用新机制 κ-卡拉胶酶和 ι-卡胶酶的活性中心均为隧道状结构，从而保证多聚体糖链能够从此处通过。这种环形结构使酶活性中心位于隧道内侧，以保证酶在释放产物后仍然能牢固结合在多糖链上，从而使酶的催化反应得以继续进行：这种酶反应的可持续性性质是保证卡拉胶酶能有效降解卡拉胶凝胶的关键凶素 。 4 卡拉胶酶活性研究 4.1 卡拉胶酶降解产物 Potin等从红藻Delesseria sanguinea表面分离到一株类噬纤维菌，用其κ卡拉胶酶对κ卡拉胶进行充分酶解，C-NMR分析酶解终产物是以κ新卡拉四糖硫酸盐和κ新卡拉六糖硫酸盐,VibrloCA-1004能够产生大量的胞外X．卡拉胶酶对κ卡拉胶和新卡拉胶寡糖硫酸盐能够产生水解作用，形成以新卡拉二糖硫酸盐和新卡拉四糖硫酸盐为主的产物。 2003年牟海津通过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析技术对卡拉胶的酶解终产物进行纯化，该酶专门水解3.6-内醚-D-半乳糖和D-半乳糖之间的β-1.4糖苷键，最后形成以κ新卡拉四糖硫酸盐和κ-新卡拉六糖硫酸盐为主。 4.2 卡拉胶酶活力研究 4.2.1 酶活测定 卡