海洋Pseudoalteromonas+spCY24中一种新琼胶酶的克隆和性质分析研究.pdfVIP

福建瑷n 第三届海洋生物高技术论坛 2005．08．19．23 海洋Pseudoalteromonas sp．CY24中一种新琼胶酶的 克隆和性质分析+ 路新枝’，韩峰，褚艳，于文功+ 中国海洋大学海洋药物与食品研究所，青岛市鱼山路5号，266003，中国 摘要：从海洋Pseudoalteromonas sp．CY24中克隆到一个新p一琼胶酶基因agaA，它的开放阅 行了重组表达，重组蛋白可分泌至发酵上清液，经镍离子柱纯化后达到了电泳纯。酶学性质 研究发现其最适反应pH为6．5，最适反应温度为40。C。通过多序列比对发现AgaA中有两段 的两个谷氨酸(E147和E152)进行定点突变，突变后酶活丧失，表明这两个位点对催化活 性具有重要的作用。琼胶酶AgaA归属于糖水解酶的16家族，是一种内切酶，水解琼脂糖链 的B一1，4糖苷键，生成新琼六糖和新琼四糖作为主要降解产物。 关键词：B一琼胶酶新琼寡糖糖水解酶 琼胶是某些海洋红藻细胞蹙组成部分，主要由琼脂糖和硫琼胶组成。琼脂糖是由(1—3) O一13一D．半乳糖和(1—4)．O一3，6内醚a．L．半乳糖交替组成的线形链状分子。琼胶酶 (Agarase)是能够降解琼脂糖的糖水解酶(GH)，根据琼胶酶降解琼脂糖的作用方式不同， 可分为两类：伐．琼胶酶作用于琼脂糖的0【(1_3)糖苷键，产物为琼寡糖，以3，6内醚Ⅱ一L。 半乳糖作为还原性末端；D一琼胶酶，水解D一半乳糖残基和3，6内醚0【一L一半乳糖残基之间的 B(1_4)糖苷键，产生的新琼寡糖以D．半乳糖残基作为还原性末端【I】。已经发现的琼胶酶， 根据其氨基酸序列相似性划分为糖水解酶家族中的GH一16，GH．50和GH一86家族 在多个领域具有重要的应用价值，已广泛应用于降解琼胶或琼脂糖制备琼胶低聚糖、从琼脂 糖凝胶中回收大片段的基因组DNA、制备藻类原生质体等方面。特别是近几年，随着糖生物 学研究的发展，’琼胶低聚糖的生物活性不断被发现，在医药、化妆品、食品等领域得到广泛 应用【5】。因此，琼胶酶日益成为海洋生物资源研究开发的热点。 本论文报道了一种来源于海洋Pseudoalteromonas sp．CY24的新琼胶酶AgaA的基因克 隆、重组表达、分离纯化、酶学性质以及催化机制。 +国家863资助课题(2004AA625020)。 +通讯作者。Email：yuw966@ouc．edu．cn。 155 福建建n 第三屠海洋生物高技术论坛 200s．08。19．23 l材料和方法 1．1agaA基因的克隆和序列分析 Pseudoalteromonas sp．CY24菌株是从青岛海域的海水中分离得到，它高产胞外琼胶酶。 Pharmacia 酶基【大I。质粒的提取和片段的同收采用Amersham BandPrep试剂盒。 SephaglasTM 电点、分子最和信号肽。 1．2重组蛋白的表达和纯化 manual中的标 system pET24一agaA，转化大肠杆菌BL21(DE3)。重组蛋白的表达参照pET 准力‘法。用镍离子4{丰从发酵上清液中分离和纯化重组蛋白，并进行SDS—PAGE分析。 1．3酶活性的检测 100}rtl适当稀释的酶液加入到9001xl含0．25％琼胶的50mmol／L磷酸盐缓冲液(pH6．5) 中，40。C保温1