电泳技术-研究生.ppt

第三章 电泳技术  Electrophoresis ;内容提纲;一、定义;4;二、电泳分析技术发展概况;三、电泳分析技术的分类;①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 ②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 ④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 ;(2) 按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳;9;10;11;12;13;14;连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如 PAGE、IFE。 优点：在不同 pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。 ;四、电泳技术的特点;五、电泳技术应用;六、电泳的基本原理; 以蛋白质分子为例:; V q M = ——— = ———— E 6?r? ;七、影响电泳速度的因素; 溶液的I 越高，质点的泳动速度越慢，但区带分离度却较清晰。 I↑→缓冲能力越大→缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少→电泳速度减慢; pH值决定了化合物解离的程度，也决定了物质所带的净电荷。 ;氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）; +++++++++ ————— ————— +++++++++（液） 负极 ← →正极 ;5. 分子筛;第二节 常用电泳技术;薄膜电泳（衍生）; 支持物：多孔凝胶。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高。;30;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）; 基本原理 SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键 。在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。解聚后的蛋白质分子与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异。 ; SDS是一个不连续系统，由上层浓缩胶和下层的分离胶组成。 浓缩胶（pH6. 8，孔径大）主要作用是使样品浓缩，使样品在未进入分离胶前，被浓缩成很窄的条带，从而提高分离效果。 分离胶（pH8. 8，孔径小） 通过分子筛效应和电荷效应，把 样品中的各组分按分子量和电荷 的大小而分开。;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）; PAGE（ polyacrylamide gel electrophoresis ）即聚丙稀酰胺是由丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）激发的。;考马斯亮染色 银盐染色 ;琼脂糖凝胶电泳（Agarose gel electrophoresis）; 琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。 ;（一）优点 1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗 2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、 病毒等大分子物质。 4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6.有热可逆性 ;（二）缺点 1. 机械强度差，易破碎，浓度不能太低。 2. 易被细菌污染，不易保存，临用前配制。 3. 琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。; 基本原理 pH为8.3－8.0时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。;基本操作步骤：; 常用仪器设备 ; 常用仪器设备 ;（三）等电聚焦电