第5章 目的基因的克隆与基因文库的构建.pptVIP

非同位素标记法 可以把生物素(biotin)等非同位素标记物连接到其中一种脱氧核糖核苷三磷酸中，然后掺入到新合成的DNA链中。要检测这种标记需要利用一种中间化合物，即链霉抗生物素蛋白(streptavidtn)，它能与生物素结合，同时它自身带有某种酶，可以催化形成有颜色的化合物，最后的结果通过肉眼就能分辨出来。 GCTTGAGCAGTAACCTG 生色底物 颜色产物 Biotin 生物素 烷烃连接臂 Avidin 生物素结合蛋白 显色酶 * 用于筛选基因文库的探针来源 一是从近缘生物体中克隆的DNA用作异源探针，这种情况的杂交条件应该调整到要允许一定程度的探针与目标DNA之间的错配，以补偿这两种的序列之间自然存在的差异； 二是根据从一个目的基因编码的蛋白的已知氨基酸序列推导出可能的核苷酸序列。通过化学合成的方法来合成一个探针。 * 基因文库的筛选过程 基因文库通常先涂布到母盘培养基上，然后再把这些菌落的样品吸印到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后裂解细胞，去掉蛋白质，使DNA变性，结合在膜上; 这时加入标记的探针，如果出现杂交信号，那么从母盘上就可以把包含杂交信号的菌落分离、培养出来(图2—24)。 * 筛选结果的分析 由于大多数基因文库都是通过部分酶解的方式构建的，因此杂交一般都会得到多个阳性克隆。要鉴定哪一个克隆包含了目的基因的完整的序列，就要通过凝胶电泳和限制性内切酶酶谱先初步分析出每一个插入片段的长度，同时也鉴定出完全相同的克隆以及有重叠序列的克隆。通过序列的重叠，就可能得到一个完整的基因，如果一个克隆中的插入大到可以包含一个完整的基因，那么就可以通过DNA测序来认定，看它是否有起始密码子和终止密码子。 在一个文库里人们有可能得不到某个基因的完整序列，这就需要用另一个不同的限制性内切酶去构建另一个文库，再用原先的探针进行筛选。还有就是构建一种插入片段比原来核基因的平均长度大的基因文库，以增加获得完整目的基因的可能性。 * 5.2.4.2 通过免疫反应筛选 如果没有DNA探针，还可以用其他的方法来筛选文库。 例如，如果一个目的DNA序列可以转录和翻译，那么只要出现这种蛋白，甚至只需要蛋白的一部分，就可以用免疫的方法来检测。 从技术上讲，这个过程与DNA杂交过程有许多共同之处。先对文库中所有的克隆都在培养基上进行培养，然后转到膜上，对膜进行处理，使菌裂解，同时释放出蛋白质附着于膜上，这时加入针对某一目的基因编码的蛋白的抗体(称为一抗)，反应后多余的杂物经洗脱除去；再加入针对一抗的第二种抗体(称为二抗)，二抗上通常都连有一种酶，如碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)等，再次洗脱后就加入该酶的一种无色底物。如果二抗与一抗结合，无色底物就会被连在二抗上的酶水解，从而产生一种有颜色的产物(图2—25)。 在培养基上培养菌落 转膜 菌落影印在膜上 裂解 菌落的蛋白质裸露出来 加一抗 一抗与裸露的蛋白质结合 洗去游离的一抗 加二抗 二抗与一抗结合 洗去游离的二抗 加显色剂 显色 找出阳性克隆 图2－25 通过免疫反应进行基因文库的筛选 * 通过免疫反应筛选(2) 根据发生颜色变化的克隆所在的位置，找出原始的培养板上与之相对应的克隆，这个克隆可能包含一个完整的基因，也可能包含基因的一部分，但即使是基因的一部分，它也能产生足以让一抗识别的蛋白结构域区域。 因此，还需要进一步鉴定阳性克隆中包含的基因是否完整。 * 5.2.4.3 通过酶活性筛选 如果目的基因编码一种酶，而这种酶又是宿主细胞所不能编码的，那么就可以通过检查酶活性存在与否来筛选目的基因。 例如，多种生物体中编码α淀粉酶、葡聚糖内切酶(endoglucanase)和β葡糖苷酶(β-glucosidase)的基因就是通过这种方法分离出来的，即先把核基因文库转入一选择性菌株，铺在带有一种特定底物的培养基上培养，筛选那些可以利用这种底物的克隆。 如果要寻找的基因所编码的蛋白对突变的宿主菌细胞的生长极为重要的话，那么将基因文库导人这些突变的细胞以后，那些能在没有所需底物的基本培养基上生长的细胞中必定就带有一个具功能的目的基因。 运用这种遗传互补的方法已经成功地分离出了许多具有重要功能的基因，包括那些与抗生素生物合成相关的和与某些植物的根上形成固氮根瘤相关的基因。 * 5.2 基因文库的构建程序 5.2.5 基因文库构建的技术性问题 在基因组文库的构建过程中，最应引起重