传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 传染性法氏囊病毒HZ2株VP5基因缺失株的构建 于涟+李龙魏永伟黄耀伟 (浙江大学动物预防医学研究所浙江省重点实验室杭州310029) NheI酶切位点作为分子标记。构建IBDVA节段突变体真核表达载体pCI-Nhe3，与IBDVB节段真核表达载 体pCI～mB，在脂质体介导下共转染鸡胚成纤维(CEF)细胞。用转染细胞的培养液上清不断地接种新鲜细胞， 模拟病毒“传代”，观察到细胞形态学发生变化，产生了类似野生IBDV感染细胞时出现的细胞病变效应(CPE)； 电子显微镜下可以看到符合IBDV病毒粒子结构的物质；间接免疫荧光分析表明病毒结构蛋白在CEF细胞得 获得拯救。本文在RNA聚合酶II系统的快速、简易的IBDV感染性克隆构建方案的基础上，构建了IBDVVP5 基因缺失毒株，为开发新一代抗IBDV的基因缺失疫苗打下基础。 bursal bursal 传染性法氏囊病(Infectious disease 免疫抑制和免疫缺陷，同时造成其它疫苗的免疫失败，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一…。预防 IBD的传统方法是用弱毒苗或灭活苗免疫鸡群，前者优于后者。但自上世纪80年代在欧洲、美国等地区开 生；我国从1991年开始报道变异株和超强毒株的出现，IBDV的有效防治面临严峻的挑战。 3。 (438bp)编码非结构蛋白VP5(约15kD)，该蛋白非病毒复制所必需，与病毒致病性有关H’5 Mundt等H1用定点突变令D78弱毒株ORF Yao等瞄1用VP5缺陷的D78弱毒株(rD78NS 剂量也不引起任何临床症状与法氏囊组织损伤，后者相反；并且两者诱生IBDV中和抗体的能力相似。进一 了RP9和CEF的细胞凋亡，而缺失了VP5拯救的病毒引起的细胞病变比野生型轻，复制速度比野生型慢， 细胞上清液的病毒量比野生型降低30倍，缺失了VP5的病毒大大降低了细胞溶解释放病毒的能力，可见VP5 具有很强的细胞毒性，与成熟病毒从胞内向胞外释放及病毒的致病性有关。 本文通过PCR方法，将ORF2 A1和ORF 酶切位点，作为分子标记的基础上，删除ORF 染性法氏囊病病毒，为进一步研制IBDV基因缺失疫苗打下基础。 1材料与方法 HZ2株是一株从杭州分离的野毒，经15代鸡胚成纤维细胞(CEF) 1．1病毒、质粒与细胞培养IBDV Q为本所保存；pGEM-T 传代所得的致弱株；大肠杆菌DH5 +通讯作者。E—mail：yulian@zju．edu．cn 15；0 中国畜牧兽医学会禽病学分会禽流感及免疫抑制病论坛论文集 pCI～AKHZ2、pCI—mB由本所构建保存。CEF细胞分离自1l～13日龄SPF鸡胚。 1．2试剂与引Concert“highpurityplasmidpurificationsystem 2000、 kit、Lipofectamine MutanBEST Trizol、D-MEM、胎牛血清(FBs)购自Invitrogen公司；TaKaRaKit、OneshotLAPCRmix， 各种限制性内切酶均购自TaKaRa公司；MMLVReverse VP5 抗兔IgG购自北京鼎国生物技术发展中心；其他试剂均为进口或国产分析纯；兔抗IBDV血清和兔抗IBDV 血清为本所自制；所有引物均由Invitrogen公司合成。 1．3感染性克隆突变体的构建 得含有IBDV