超声波辅助Urea-Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质.pdfVIP

第38卷 分析化学(FENⅪHUAXUE)研究报告 第5期 2010年5月 ChineseJoumalof Chemistry 663～667 Anal”ical DoI：10．3724／sP．J．1眇6．加lO．0嘶63 超声波辅助Urea．Free试剂结合热变性快速酶解蛋白质 李雅萍1 李友元“ 周新文2 陈长华1 张嗣良1 杨芄原2 1(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237) 2(复旦大学生物医学研究院，上海200032) 摘要建立了一个超声功率．超声时间的安全区域，在此范围内进行超声波辅助酶解时，能避免超声波随机 断裂蛋白质；在此安全区域内采用响应面法获得最佳超声功率和超声时间。建立了超声波辅助Urea．Free试 剂结合热变性快速酶解蛋白质的方法，将蛋白质依次进行10min超声波浴辅助urea．Free还原烷基化反应、 90℃热变性15 IIlin，超声波辅助胰蛋白酶酶解15s。应用此快速酶解方法鉴定3种典型标准蛋白质(牛血清 白蛋白、细胞色素c和肌红蛋白)，在25min内达到与传统整夜酶解方法相同的鉴定结果，并获得更高的序列 覆盖率。 关键词超声波辅助；热变性；蛋白质；酶解；质谱 1 引 言 目前，用于蛋白质鉴定的方法主要有二维电泳一质谱法和多维色谱一质谱法…。两种方法在酶解后 均需要一系列化学处理和提取、纯化步骤以回收酶解碎片，冗长的样品制备过程增加了损耗和污染蛋白 质的风险。目前，有关减少蛋白质鉴定前样品预备的时间的方法较多，这些方法主要专注于提高样品处 理的通量，基于在酶解步骤中提高温度、使用含有流动胰蛋白酶的柱、加入有机溶剂、用超声波和微波增 强胰蛋白酶活性等悼J。Capelo等一圳采用高强度聚焦超声波辅助胰蛋白酶快速酶解蛋白质。Park 等一1在蛋白质酶解和质谱分析之前进行蛋白质的热变性，但在热变性过程中蛋白质易聚集，因而未能 被广泛采用¨0|。本研究综合考察热变性、非尿素试剂变性和超声波辅助等多因素对蛋白质溶液中酶解 效率的影响，克服了单因素存在的缺陷；简化了样品预处理步骤，节省了时间，建立了高效率和高通量的 蛋白质酶解方法。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 4700 MALDI—TOF—MS(AXIMAQIrI’，日本岛津公司)，JY92一II型超声波破碎仪(宁波新芝生物科技 发有限公司)。蛋白质组学常用试剂、标准蛋白质及胰蛋白酶(Pmteom PAGE常用试剂(Merck公司)。混合蛋白质标准样品(TaKaRa公司)。 2．2实验方法 2．2．1 mmoL／L 配制标准蛩白质溶液用25 mmoL／L二巯基苏糖醇(D1flr) NH。HCO，溶液分别配制20 溶液和100mmoL／L碘乙酰胺(IAA)溶液，并制得浓度为20g／L各标准蛋白质溶液。 DrI．I． 2．2．2蛋白质变性传统试剂变性过程：在蛋白质样品中加入16moL／L尿素溶液和20㈣L／L mmoL／L moL／L和10 h；加人100 IAA溶液，使 溶液，使尿素和DrITI终浓度分别为8 mmoL／L；37℃恒温1 I从终浓度为DTT终浓度的5倍，于暗处室温反应45min。热变性过程：蛋白质样品在90℃水浴中保 温15 2009一lO．20收稿；2009一12．1l接受 本文系国家科技支撑计划项目(No．2008BAl63肋1)、生物反应器工程国家重点实验室专项经费(No．2060204)资助 幸E·mail：yyli@ecust．edu．cn