基因工程课件4——实验3：聚合酶链式反应技术.pptVIP

安徽大学生命科学学院 实验三 聚合酶链式反应技术 （PCR技术） 实验目的与要求 掌握PCR反应原理 学习引物序列的设计 学习PCR反应体系的设计 学习PCR反应程序参数的设计 学习通过聚合酶链式反应(PCR)在体外大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。 Contents 一、实验原理 二、实验材料 三、实验步骤 四、预期结果 五、注意事项 一、实验原理 1、聚合酶链式反应技术简介 2、基本原理及特点 3、一个典型PCR的反应体系及程序参数介绍 4、DNA聚合酶 5、寡核苷酸引物的设计 1、聚合酶链式反应技术简介 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称PCR技术，是1983年，美国科学家K. B. Mullis发明的一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。 PCR技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆， 目的基因检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 2、PCR技术基本原理及特点 PCR技术实际上是在模板DNA， 引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。 反应主要涉及三个反应的循环： ①高温变性（denaturation），发生链的分离； ②低温退火（annealing），发生引物杂交； ③适温延伸（extension），发生DNA合成。 （1）PCR缓冲液 含50mmol/L KCl及Tris-HCl（pH 8.3） （2）MgCl2 二价阳离子对于酶活性是必须的，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无效。Mg2+的最佳浓度相当低（一般1.5mmol/L ），且模板DNA中的EDTA及dNTPs中的负电离子基团——磷酸根等都会影响到Mg2+的有效浓度。 在开始新的PCR组合时，可在0.05mmol/L~5mmol/L之间，设0.5mmol/L的梯度，进行PCR，来摸索最佳Mg2+浓度。 Mg2+浓度对PCR扩增反应的特异性和产量有着显著影响。浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍 （3）dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸） 每种dNTP的终浓度为50-200μmol/L，一般在饱和浓度下使用，即每种200μmol/L。 （4）模板DNA 闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA。 对哺乳动物基因组DNA扩增，每次反应约需1~0.1μg，对于细菌或质粒DNA，仅为pg（10-12g）到ng（10-9g），还可以直接以细胞为模板。 4、DNA聚合酶 （1）Taq酶 TaqDNA聚合酶是于1986年从一种生活在75℃热泉中的栖热水生菌中分离纯化出来，具有3个重要的特性： 耐高温 最适温度是72℃，连续保温30min，仍具有相当的活性，且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力。 具有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性 使扩增的DNA的3’端多带上一个“A”，有利于进行TA克隆。 在体外，失去3’—5’方向外切酶校正活性，有参错情况出现。 在一次典型的PCR反应中，其参错率约为1/2*104核苷酸，在体内是1/109核苷酸。 （2）高保真酶 但没有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性，引物需要设计限制性酶切位点，以便后续的克隆。 （3）酶量控制 根据片段长短，循环数多少。并非越多越好，加酶过多，会导致非靶序列扩增。在其他参数最佳时，每100μl反应液中含1-2.5u Taq DNa酶。酶浓度太高，会出现非特异性扩增，而过低时，则扩增产量太低。 5、寡核苷酸引物的设计 引物 引物 3’ 5’ 5’ 5’ 基因组 * 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 * 引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 引物设计关键点 与模板的互补及错配情况：应有效结合到目的序列上，尽可能不与其他部位结合。且两引物的结合位点之间一般为1~2kb，超过3kb扩增效率大大降低。3’端要求完全互补，尤其3‘端最后5~6个核苷酸的错配应尽可能的少。一般5’端可以添加一些限制性酶切位点及其保护碱基，不会影响引物特异序列的退火。 引物长度：一般为20~30个碱基长，最低不能少于16个。引物太短很可能会同非靶序列杂交，得到非预期的扩增产物。一般每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍。但不能太长，太长增加成本，且引物同模板DNA的杂交速率下降，影响PCR反应效率。 引物序列：尽量使其GC含量为50%左右，