基因的克隆与表达-2005.pptVIP

lacZ基因编码?-半乳糖苷酶 lacI基因编码阻遏蛋白,使lacZ不能表达 诱导物与阻遏蛋白结合,lacZ表达 乳糖操纵子 乳糖操纵子的表达调控 pUC载体(含lacZ’、lacI基因） 诱导物(IPTG) lacZ’表达 ?-半乳糖苷酶N端片段（?-肽） 宿主细胞lacZ?M15 缺陷型?-半乳糖苷酶 ?-半乳糖苷酶 X-gal变兰色 pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活1 pUC载体(含lacZ’、lacI基因） 外源基因插入 lacZ’失活 不产生?-半乳糖苷酶N端片段（?-肽） X-gal不变色，呈白色 pUC载体蓝白斑筛选的原理----插入失活2 3、 pGEM系列 pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子 pGEM-1—MCS两侧有SP6、T7RNA聚合酶启动子 1、可进行体外转录 转录具有特异性 可分别转录插入片段的两条链 转录产物可制备体外翻译的模板、探针及反义RNA 2、为插入片段的测序提供特异引物位点 pGEM-3/4Z----MCS位于lacZ’基因内部 插入失活—蓝白斑筛选 具有SP6、T7启动子 pGEM-3Zf(+)/(-)----引入丝状噬菌体f1(+)/(-)复制起始点 可以产生单链DNA，并分泌至上清中，便于对插入片段进行测序 F1的方向(+/-)决定复制哪一条链 4、 T-vector—用于PCR产物的直接克隆 载体DNA两条链的5’端有一个游离的T：PCR产物的直接克隆 SP6、T7启动子：体外转录、为克隆产物的测序提供特异性引物 插入位点两侧的酶切位点：为回收克隆片段进行亚克隆提供便利的酶切位点 5、pCDNA3----穿梭载体 穿梭载体（shuttle vector) 即可以携带外源基因在原核细胞中复制，又可以使其在真核细胞中表达的载体。 小 结 质粒的发展趋势： 调整质粒结构、提高载体效率：减小分子量、引入MCS 引入多种用途的辅助序列: lacZ’、lacI基因：蓝白斑筛选 SP6、T7RNA聚合酶启动子：体外转录 F1复制起始点：产生单链DNA 真核启动子：穿梭载体 二、 ?噬菌体载体 （一）λ噬菌体的分子生物学 1、λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 2、λ-DNA： 线状双链DNA分子，全长48.5kb 两端各有一个12核苷酸的互补单链（粘性末端，GGGCGGCGACCT, CCCGCCGCTGGA，称为 Cos位点（cohesive end）或cos区。 功能相近的基因在基因组中聚集在一起。 噬菌体生物学性状介绍 3、基因组成： Cos位点（cohesive end)： λ DNA分子两端各有一个12碱基长的互补单链顺序，是天然的粘性末端，称 cos位点 左臂（编码外壳蛋白）：头部基因（7个）、尾部基因（11个） 右臂（负责裂解宿主细胞、DNA自主复制以及调控)：裂解基因（2个） 中间段(控制基因组整合到寄主基因的基因)：DNA复制及溶菌生长非必需区（重组基因、正调控基因、负调控基因）、DNA合成基因 cos位点的作用 4、生活周期—温和性噬菌体 （二）λ－DNA载体的构建 建立λ克隆载体前需要解决2个问题： 　　1）包装容量有限：λDNA分子只能增加5%的大小，意味着只能插入3kb的DNA分子。 　　2）酶切位点复杂： λ基因组非常大，对于每一种酶来讲都含有超过1个的识别序列，酶切后产生多个片段，连接不能形成λ基因组。 两种解决方案： 1）缩短长度：λ－DNA上约有40-50%的DNA片段是复制，裂解所不必需的，将之切除便可提高载量。 2）修饰酶切识别位点：利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。 天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。 自然选择法：利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。 （三） λ噬菌体载体 1、基本组成元件 Cos位点 左臂（头尾基因） 右臂（裂解基因） 酶切位点 噬菌体载体 2、类型： 插入型载体：含有单个或多个单一酶切位点供外源基因插 替换型载体：含有一对或多对酶切位点便于外源基因替换 基因的克隆与表达 山东大学医学院免疫学研究所 马春红 基因工程（Genetic engineering,Ge):通过体外重组技术,人为操作基因、改造基因，改变生物遗传性状的过程。 基本手段：分子生物学技术 （体外重组、杂交、电泳等） 目的：基因克隆 基因表达 主要内容 基因工程的克隆载体(genetic cloning vector) 基因克隆(g