基因操作技术原理.pptVIP

温度（℃） 时间（min） 94 72 60 94℃变性（1min） 60 ℃退火（1min） 72 ℃延伸（1.5min） 循环1 循环2 循环3 PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。 PCR反应的温度循环周期 Typical PCR Thermal Profile *This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length 每一轮聚合酶链式反应可使目的基因片段增加一倍 30轮循环可获得—230个基因片段 Reaction Condition for a Typical PCR Assay Some DNA Polymerases Used in PCR Characteristics of Taq Polymerase 与待扩增的靶DNA区段两端序列（5’端）互补，的人工合成的寡核苷酸片断。 PCR引物 a.其长度通常在15～30个核苷酸之间。 419＝2.75X1011, 人类基因组长度3X109. b.3’端碱基必须与模板互补（5’ 3’延伸方向） c. G＋C含量50%～60%，嘌呤、嘧啶避免连续排列，一 对引物之间不能有2个以上的碱基互补，防止引物间产生引物二聚体，避免回文序列。 d.退火温度低于引物本身Tm值5℃。 PCR技术的特点: 1.特异性强 2.敏感性高 3.快速 4.简便 5.可扩增RNA和cDNA 6.对起始材料要求低 7.有一定程度单核苷酸碱基错误掺入 PCR扩增的长度：2kb 特异性 引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。 第二章 基因操作的主要技术原理 第一节 核酸的凝胶电泳 第二节 扩增原理(PCR) 第三节 分子杂交 第四节 测序 一、原 理 二、分 类: 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 核酸的凝胶电泳是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 第一节 核酸的凝胶电泳 带有负电荷的核苷酸链（DNA或RNA），依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。 根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 一、 原理 分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快； 同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型 Separation Range Vs. % Agarose PolyAcrylamide Gels 琼脂糖凝胶的分辨力在0.2～50Kb之间 聚丙烯酰胺的分辨力在1～1000bp之间 凝胶电泳的分辨力与凝胶的类型和密度相关 Agarose gel electrophoresis 溴化乙锭（ethidium bromide，EB） 在放大的电泳照片上,以样品槽为起点,用卡尺测量λDNA的EcoRⅠ和HindⅢ酶切片段的迁移距离,以厘米为单位。以核苷酸数的常用对数为纵坐标,以迁移距离为横坐标,在坐标纸上绘出连结各点的平滑曲线,即为该电泳条件下DNA分子量的标准曲线。 DNA分子量标准曲线的制作： 在放大的电泳照片上,用卡尺量出DNA样品各片段的迁移距离,根据此数值,在DNA分子量标准曲线上查出相应的对数值,进一步计算出各片段的分子量大小。 二、 分类－琼脂糖凝胶电泳（RNA变性凝胶电泳） RNA由单链核苷酸组成，其局部可形成双链的二级结构或三级结构。因此欲测定RNA较准确的分子大小，必须在变性条件下进行电泳。其他同DNA电泳。 RNA变性条件下进行电泳，所使用的变性剂有甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素和甲酰胺。尿素和甲酰胺通常用于RNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，因为它们会影响琼脂糖固化。