第一专题基因工程.ppt

⑦脂质体介导法 脂质体是由人工构建的磷脂双分子层组成的膜状结构，可以将DNA包在其内，并通过脂质体与原生质体的融合或由于原生质体的吞噬过程，把外源DNA转运到细胞内。 优点是包在脂质体内的DNA可免受细胞DNA酶降解。 ⑧花粉管通道法 将外源DNA涂于授粉的枝头上，使DNA沿花粉管通道或传递组织通过珠心进入胚囊，转化还不具正常细胞壁的卵、合子及早期的胚胎细胞。 这一方法技术简单，一般易于掌握，且能避免体细胞变异等问题，故有一定的应用前景。 病毒种类多样及病毒DNA或RNA构建的载体性质的各异，所以转导的过程各不相同，主要有三种类型： 一，带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒。 二，带有目的基因的毒病是缺陷性的，须同另一辅助病毒一起感染受体细胞．在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。 三，虽然带目的基因的SV40病毒是早期转录缺陷型的，但被感染的COS细胞系的基因组中整合有SV40早期转录区段DNA，所以没有必要用辅助病毒作混合感染。 ①病毒颗粒转导法 5. 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 ②磷酸钙转染法 其依据是哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 DNA磷酸钙共沉淀复合物中DNA的数量、共沉淀物与细胞接触的保温时间、以及DMSO和甘油等促进因子作用的持续时间均会影响DNA的转染效率。 ③DEAE-葡聚糖转染法 二乙胺乙基葡聚糖(DEAE)是一种高分子质量的多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞捕获外源DNA，实现短时间的有效表达。 目前有关DEAE-葡聚糖的作用机制一般认为DEAE-葡聚糖能与外源DNA形成复合物，保护DNA免受核酸酶的降解；其次是DEAE-葡聚糖可作用于受体细胞膜，增加其通透性，便于DNA进入。 此方法简单、重复性高，并且转染效率高于磷酸钙法。 ④聚阳离子-DMSO转染法 采用聚阳离子poly-brene（聚凝胺 ）处理哺乳动物细胞，增加细胞表面对DNA的吸附能力、然后再用25％-30％DMSO短暂处理细胞，增加膜的通透性，提高对DNA的捕获量。 ⑤显微注射转基因技术 应用显微注射器可以把重组DNA直接注入哺乳动物细胞。 用此方法转基因的效率很高。获得稳定转化子的数量取决于注射的DNA的性质。 ⑥电穿孔DNA转移技术 原理同植物的电穿孔转移DNA法。 在电脉冲处理之前，先用乙酰甲基秋水仙碱预处理细胞10h，可提高转化效率3-10倍。这很可能是由于预处理导致中期停顿的细胞中，细胞核处于无膜状态，或者核膜具有较高的通透性所致。 ⑦脂质体介导法 利用脂质体介导法将外源DNA导入哺乳动物细胞具有实用潜力。 由于脂质体具有无毒、无免疫原性的特点，不仅可用于体外受体细胞的基因转化，而且可以在动物体内将基因转入肝细胞、血管内皮细胞等靶细胞或靶组织、靶器官位点，实现瞬间表达或稳定表达，成为基因治疗的一种有效工具。 ⑧精子介导法 精子与外源DNA共浴后再给卵子受精，使外源DNA通过受精过程进入受精卵并整合于受体的基因组中。 可以用电穿孔、脂质体包埋辅助。 五、重组子的筛选 （一） 克隆子的筛选 概念 克隆子 转化子 重组子 将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。 把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子 ），现在这两者有通用的趋向。 含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子 。 在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。 经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。 1.遗传表型直接筛选法 1.1 根据载体选择标记初步筛选转化子 在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。  一般的做法是将转化处理后的受体细胞接种在合适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。 常用的选择标记基因主要是抗性基因以及表达产物可以发光或使反应底物显色的基因，配制的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用选择培养基是根据宿主细胞类型相应的选择条件是可以被抗性基因产物分解的抗生素和除草剂，可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。 LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。 （1）抗药性