第三章：PCR技术及应用.ppt

PCR技术;主要内容;; 聚合酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);体内DNA的复制体系;Mullis的PCR构思;(二)反应过程;一生二、二生四、四生万物;; PCR反应体系成分;（1）模板 ①单、双链DNA均可 ②模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败的关键环节之一，因此，不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 ③模板浓度要适中，过高导致反应的非特异性增加。;（2）引物 引物是PCR特异性反应的关键； PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度； 反应体系中引物的浓度一般在0.1~0.2μmol/L之间，浓度过高容易生成引物二聚体或非特异性产物； 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增;引物设计的原则;（3）dNTP ①dNTP浓度取决于扩增片段的长度一般为 20~200μmol/L ②四种dNTP浓度应相等，不等会导致错配 率升高；浓度过高易产生错误碱基的掺入， 浓度过低则降低反应产量 ; ;（5） Mg2+ ①Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 ②Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量 下降； Mg2+过高影响