利用反向遗传学技术获得适应RK13细胞的兔出血症病毒研究.pdfVIP

经济动物传染病 异性。 3小结与讨论 本试验研究了用重组RVN蛋白作为ELISA诊断抗原的可行性。试验从重组蛋白的表 达、反应原性鉴定以及蛋白的提取和纯化到作为抗原包被进行ELISA反应，确定了抗体间 接ELISA检测法的最佳工作条件，为建立检测RV抗体的间接ELISA方法奠定了基础。 大肠杆菌表达系统是使用非常广泛的表达系统之一。然而，以E．coli表达的外源蛋白作 抗原用于检测动物体内某一病原特异性抗体时，面临的最大问题是纯化的抗原中存在E．coli 成份的污染而使检测结果出现假阳性。本试验用破碎的大肠杆菌上清做抗原吸附待检血清中 人肠杆菌抗体，通过实验证明该方法是可行的，这也为减少ELISA反应的非特异性提供了 一条新思路。ELISA方法检测RV抗体与其他血清学诊断方法相比有许多优点：ELISA方法 速度快，对实验要求不高，不需要无菌操作，可以自动化操作，安全便捷，在短时间内可以 检测大量样品，适于实验室血清学诊断及大规模疫病普查。此外，ELISA检测法比较灵敏， 而且结果也较为可靠。 在RVERA株核蛋白基因中，大肠杆菌稀有密码子只有31个，使用频率很低，仅为6．7％， 所以其能在大肠杆菌中高效表达，表达量高达56．8％。在推导的核蛋白氨基酸序列中只有3 个潜在的糖基化位点，因此通过大肠杆菌表达系统表达不会影响核蛋白的生物学活性。两种 方法对血清样品进行检测结果的符合率为86．7％，试剂盒是用纯化的狂犬病毒包被，其检出 的抗体为多抗，而用本试验建立的方法检出的是抗核蛋白抗体，这可能是两种方法检测结果 差异的原因。 成熟的狂犬病毒颗粒有囊膜，其结构蛋白主要包括核蛋白(N)、糖蛋白(G)、磷蛋白(NS)、 基质蛋白(M)和依赖RNA的RNA多聚酶(L)。N为核衣壳蛋白，与病毒核酸结合组成病毒的 核糖核蛋白(RNP)。它是RV的主要结构蛋白，其含量高，不同毒株之间有高度的保守性。 Takita等研究证明，抗狂犬病毒核衣壳抗体具有抵御狂犬病毒攻击的保护作用，在体内能抵 抗狂犬病毒感染，而且狂犬病毒核蛋白抗体在体外也具有抑制狂犬病毒的复制功能【9’l01。因 此，以重组RV N蛋白为诊断抗原建立的间接ELISA方法检测到的抗体滴度在一定程度上 也就代表了机体保护性抗体水平的高低。 参考文献略 利用反向遗传学技术获得适应RKl3细胞的兔出血症病毒 刘光清倪征云涛张玉颖盛祖恬 (浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所，农业部病毒学与生物技术重点实验宣。浙江杭州，310021) disease 摘要：本研究在前期构建的兔出血癌病毒(Rabbithemorrhagicvirus，RHDV)全长cDNA分子的基 础上，利用SP6RNA聚合酶系统，在体外转录合成了病毒RNA。然后用转染试剂将病毒曳NA导入RKl3 细胞，12h后可见明显致细胞病变(CPE)，用间接免疫荧光方法在RKl3细胞中也检测到了病毒抗原的产 生。将收获的细胞培养物再次接种RKl3细胞，仍然能产生明显病变，其半数组织感染量(TCID50)可达 104．6／ml。最后大量收取细胞培养物，经差速离心法纯化病毒后，在电镜下可观察到RHD病毒粒子．上述 实验结果证明我们利用反向遗传学技术首次获得了可适应于RKl3培养的RHDV，为将来研究RHDV的分 子致病机理和新型疫苗等提供了有利的工具。 关键词：兔出血症病毒；反向遗传学；全长eDNA；RKl3细胞 disease 兔病毒性出血症病毒(Rabbithemorrhagic virus，RHDV)是一种对兔具有高度致病 性和致死性的病毒，所引发的疫病俗称”兔瘟”，其病死率高达100％，是一种对养兔业危害 (Lagovirus)…。迄今所发现的RHDV均属于同一种血清型，与杯状病毒科的其它成员， 如猫杯状病毒(FCV)、诺沃克病毒(NV)等没有交叉发应【2】。在形态上，RHDV与其它杯 状病毒科成员一样，也是星球型，直径30rim左右，无囊膜，核衣壳呈20面体对称，由32 ．．626．． 第六届理事会第二次会议置教学专业委员会2006年会议论文集 个颗粒组成，在核衣壳上整齐地排列着中空的杯状结