O-GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达的抑制对tau蛋白磷酸化作用的影响精选.pdfVIP

PII]I] s Ⅵ ．pibb．ac．cn 0．GIcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达的抑制 对 tau蛋白磷酸化作用的影响水 杨江勇 顾建兰 施建华 刘 飞 沈 勤 f南通大学医学院生物化学教研室，南通 226001) 摘要 研究HEK293T细胞中O—GlcNAc糖基转移酶(OGT)基因表达抑制对与AD密切相关的tau蛋白磷酸化与糖基化修饰的 影响．以OGT基因为靶点设计三段 siRNA(OGT．siRNA。-3)，用脂质体的方法转染OGT．siRNA～进入HEK293T细胞，通过 RT．PCR检测OGT．siRNA¨对OGTmRNA的抑制．将pEGFP／OGT与OGT．siRNAH共转染HEK293T细胞，24h后在倒置 荧光显微镜下观察各组GFP／OGT的表达，根据 GFPO／GT的表达量来评价 OGT—siRNA，对 OGT基因表达的抑制率．将筛 选出的具有最佳沉默效果的OGT．siRNA与质粒pCUtau“共转染HEK293T细胞，48h后Westernblot检测 tau蛋 白糖基化与 磷酸化修饰的变化．OGT．siRNA 在 100nmol／L的终浓度时对OGT基因的抑制效率最高．与Mock组相比，对OGT基因 mRNA及蛋 白质水平的抑制率分别可达 80．0％与 51．3％左右．OGT基因表达的下调使 tau蛋白糖基化水平下降，而磷酸化水 平增高，证实tau蛋白的糖基化负调节其磷酸化，葡萄糖摄入减少或代谢降低可能在AD的发生发展中起关键作用． 关键词 阿尔茨海默病，tau蛋白，O—GlcNAc糖基转移酶，RNA干扰 学科分类号 R749．1 DOI：10．3724／SP．J．1206．2008．00326 阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdieases，AD)是一种 在 OGT的催化下，经由0一糖苷键从UDP．GlcNAc 原发性进行性神经系统变性型疾病，病理改变 以大 供体转移并连接至蛋白质的丝氨酸或苏氨酸残基的 脑弥散性萎缩和神经细胞变性为主 ．病理特征是脑 羟基上l5J．O．GlcNAcase的功能则是将 O．GlcNAc 内老年斑(senileplaques，SP)的聚集，神经元纤维缠 从蛋 白质丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上去除． 结(neurofibrillarytangle，YVT)形成与神经元数量的 UDP．GlcNAc由葡萄糖经 己糖胺途径合成 ．AD患 减少 ．SP的主要成分是 B淀粉样蛋 白(B—amyloid 者脑 内葡萄糖代谢障碍与摄入减少 ，使 UDP— protein，AB)．早在 1986年 ，Neve就发现 NFT 由 GlcNAc合成受到影响，导致 tau蛋 白0一GlcNAc 变性双股螺旋纤维(pairedhelicalfilament，PHF)所组 糖基化水平降低． 成，PHF的主要成分是高度磷酸化 的tau蛋 白．大 有研究证实，大量的O—GlcNAc糖基化位点与 量证据表明，tau的异常过度磷酸化在AD 的神经 脯氨酸磷酸化蛋 白激酶位点(SerT／hr1相似 6【】．在体 元退行性病变 中起关键作用[，~4I．tau异常过度磷酸 外培养的大鼠脑片和神经细胞 中，用 O．GlcNAc糖 化机制成为AD发病机制研究的热点． 苷酶抑制剂处理 以增加 O．GlcNAc糖基化的水平 ， 0一GlcNAc糖基化为 0位N一乙酰葡萄糖胺 则明显抑制 tau蛋 白多个位点的磷酸化[7J．饥饿引 (0．1inkedN—acetylglucosamine，O．GlcNAc)糖基化 ， 起小鼠大脑皮质中总tau蛋 白和 tau蛋白的糖基化 是一种动态的蛋白质翻译后修饰方式．有两种酶参 水平降低，同时tau蛋白磷酸化水平升高，且饥饿 与蛋白质的O．GlcNAc糖基化过程．一种是催化蛋 引起的tau蛋 白糖基化和磷酸化改变均在恢复进食 白质 O—GIcNAc糖基化反应的O．GlcNAc糖基转移 酶 (O—p-N—acetylgl