华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳PPT.ppt

实验四  LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳 一、实验目的： 1.了解聚丙烯酰胺凝胶的制作过程及结构特点。 2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及分离乳酸脱氢酶同工酶的电泳过程。 二、实验原理 1. 聚丙烯酰胺凝胶原理及影响因素（同实验三） 2．聚丙烯酰胺凝胶电泳原理（同实验三） 3. 乳酸脱氢酶(LDH)同工酶圆盘电泳 同工酶是指生物体中结构和性质不同而能催化相同反应的一类酶。许多酶都具有同工酶（约占已知酶的40～50%），凝胶电泳可利用同工酶结构上的差异而将之分离。 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的酶。 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称 LDHl ，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶(isoenzyme)的概念。 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M（LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4（LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及肝中LDH5 含量高。 三、实验材料、仪器和试剂 (一)实验材料（由老师准备） 兔子血清和组织(肝脏组织、心脏组织、肾脏组织、肌肉组织、肺等)提取液（组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1∶10（g/mL）。 组织样品处理：称取0.5克兔血清和肝脏等组织，各加入5mLPBS和少量石英沙于研钵磨成匀浆，离心10000r/10～15min，取上层清液4 ℃保存作为母液。 电泳样品：用移液枪各取1mL上述提取液，加1mL40%蔗糖溶液和20uL溴酚兰，混匀。 (二) 仪器及器皿 1 全班共用： 圆盘电泳槽 直流稳压电电泳仪 恒温水浴锅 微量加样器 移样器 电炉等 电泳槽3个(12个管/个)，电泳仪3个，200mL烧杯10个，100mL容量瓶5个，1000mL容量瓶1个(或1000mL量筒1个)，广泛pH试纸，塑料大烧杯（2L）2个, 塑料大烧杯（L）1个，剪细滤纸条1杯。 2 每组配备 长滴管1支，玻管及乳胶管（带玻珠）2个，长针头注射器1支，试管2支，洗耳球1个，10 mL离心管2个，玻棒。 (三)、试剂 1 制备样品有关试剂（老师配） （1）0.01mo1／L pH 6.5磷酸盐缓冲液（PBS），用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4·12H2O 0.2256g ，NaH2PO4·H2O 0.2137g，加水定容到200mL。 （2）40%蔗糖溶液 20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 （3）0.5％溴酚兰 10mL 2、制备PAGE的试剂 （在通风橱里加浓HCl），每大组（3个小组）配以下试剂 （1） 凝胶贮备液A：称Tris（三羟甲基氨基甲烷） 9g于100mL烧杯中，加浓HCl 1 mL，TEMED（四甲基乙二胺）原液 0.18 mL，于量筒加水定容至25mL，用试纸检测pH为8.9。 （2） 凝胶贮备液B：丙烯酰胺（Acr）15g，甲叉双丙烯酰胺（Bis）0.4 g;，加水于100mL烧杯中溶解，然后混合于容量瓶加水定容至50mL，如果有沉淀要过滤。 （3） 凝胶贮备液C：过硫酸铵0.14g，溶解后，于容量瓶加水定容至50mL（制胶时现配现用）。 （4） 电极缓冲液：Tris 3g，甘氨酸16g，加蒸馏水溶解并定容至300 mL，pH为8.3，使用时稀释10倍。（每个电泳槽可装1000 mL的电极缓冲液，12支管/盘，3个圆盘/班） 3 、LDH同工酶染色贮存液(电泳过程中配制) (1)、5mg /mL NAD+（氧化型辅酶I）溶液：称 400mg NAD+定容至80mL，置棕色瓶中，4°C可保存2星期。 (2)、1mol/L乳酸钠 （分子量 112.06）：取 60%乳酸钠4.6 mL定容至50 mL，置棕色瓶中，4°C度保存。 (3)、0.1mol/L NaCl：取0.584g NaCl，加蒸馏水溶解并定容至100mL。 (4)、1mg/mL 甲硫吩嗪(PMS)：取甲硫吩嗪(PMS) 25 mg PMS，加蒸馏水溶解并定容至25mL。 (5)、1mg/mL 氯化硝基四氮唑蓝(NBT)溶液：160mg NBT，加蒸馏水溶解并定容至160mL,于棕色瓶4℃保存。每次用完请妥善保管。当黄色NBT变绿色或出现沉淀，不能再使用。 （6）、0.01mol/L pH 6.5 PBS（磷酸盐缓冲液，全班共用的量）：Na2HPO4·12H2O 0.2256g ，NaH2PO4·H2O 0.2137g，加