mirRNA的定量试验计划.docVIP

实验目的：RD细胞定量检测miR188;miR657; 实验材料及试剂：超净台 （上海净化设备厂） 生物安全柜 （ESCO，Singapore）,细胞培养箱 （Heraeus，Germany）,分光光度仪 （Eppendorf，Germany）,PCR仪 （Eppendorf，Germany）,冷冻离心机 （Eppendorf，Germany）,移液枪（Eppendorf，Germany），（real-time试剂盒（takara），显微(coic,重庆光学仪器厂），计数板；,异丙醇（上海化学试剂有限公司），八连管；100%乙醇（上海化学试剂有限公司）,细胞培养液 （Gibco，USA），氯仿（上海化学试剂有限公司）,EDTA-胰酶 （Gibco，USA）,Trizol （Invitrogen，USA） 三、实验过程 RD细胞的收集 1.培养传代RD细胞，待细胞生长状态良好，密度约80%时进行收集； 2..倒掉细胞培养液，加入1ml的胰酶于培养瓶中，混匀后将其吸掉（防止消化过度)静置，在显微镜下观察细胞开始变圆（细胞成流沙状流下时）； .加入1ml的培养液，吹打混匀，对其进行细胞计数，按照公式（四个大方格/4)×104×稀释的倍数=细胞原液量/ml.记录数据。取出200ul的该细胞悬液于经DEPC处理的EP管中。 Trizol抽提总RNA 取出上步所收集到的细胞悬液。 加入1ml Trizol，颠倒3-4次，室温静置10min。 每1ml Trizol加入0.2ml氯仿剧烈震荡15sec，室温放置5min。 4℃，12000g低温离心15min，此时样品分为三层：上层为无色水相，中间层为白色底层为黄色有机相。 吸约650ul的上清液于新的Eppendorf管。 加入等体积650ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下20min(-20℃沉淀1小时以上)。 4℃，12000g低温离心15min。 去上清，加入1ml 75%乙醇，4℃，10000g低温离心8min，重复一次。 倒掉乙醇，自然晾干，不可用太大力；室温放置5～10min干燥RNA沉淀。 用含有1U/μl RNA酶抑制剂的水20 μl溶解。 收集标记提取出的RNA,待用； RT 注意：做之前要用分光光度仪测定RNA的量； 水的量要根据实验的具体情况来加，使得最后反应体系是10ul。 在此步的同时要做内参5sRNA的逆转录 2.反应体系如下：(分开进行，三组反应） RNA 2.0ul(0.1-1.0g) HN RT-X(1uM) 1.0ul 2.5mMdNTP 2.0ul(Final 0.5mM) dH2O 2.0ul HN RT-657 HN RT-188-3p R-5SrRNA 80℃变性5分钟，然后迅速在冰上急冻5分钟. 向反应管中加入： 5×RTBuffer 2.0ul RTase(100-200U/ul） 1.0ul 42℃45min.后85℃5min使得逆转录酶失活。 （ 四）Real-time PCR HN miR-X-F(1uM) 1.0ul HN miR-X-R(1uM) 1.0ul cDNA 2.0ul 2xSyBGreen Mix 5.0ul dH2O 1.0ul 1.cDNA稀释 10ul水 10ul水 10ul水 10ul水 10ul水要用到六排八连管，每三排为一组，分别测定miR188a-3p和miR657。样本做两排，做复孔，每一排的第一孔加水做阴性对照；前两排的其余七孔按照上图稀释的倍数按顺序加入不同稀释度的样本反应液；第三排的其余七孔加内参5sRNA的不同稀释度的反应液，同样的顺序。 95℃10min 95℃ 5s 60℃ 10s 40-45 循环  注意：要用5sRNA做内参和水做阴性对照；做复孔； 10ul水 5倍稀释 10 20 40 80 160 320 10ul HN miR-657-F F-