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ELISA法检测抗-HBs
实验目的 1.掌握ELISA的原理和操作方法 2. 实验原理 本实验采用ELISA双抗体夹心法检测抗-HBs-Ag，首先用已知抗HBs抗体包被载体，然后加入待测血清，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，在加入酶标记抗HBs抗体，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 实验材料 1.豚鼠Anti-HBs。 2.待测血清，阳性，阴性对照血清。 3.HBR标记豚鼠Anit-HBs。 4.包被缓冲液（0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液）。 5.洗涤液（0.01mol/L pH7.4 Tris-Cl-Tween20）。 6.稀释液（0.01mol/L pH7.4PBS）。 7.显色液（邻苯二胺-pH5.0碳酸盐-柠檬酸缓冲液）。 8.终止液（2mol/L H2SO4) 9.酶仪表、冰箱。 实验步骤 实验结果 注意事项 1.包被缓冲液，洗涤液、稀释液等可提前配制，于冰箱中短期保存，使用前观察是否变质。 2.加样量力求准确，加样时应将液体加入孔底，避免加在孔壁上部，并出现气泡。 3.ELISA操作需要一定温度孵育，为避免蒸发，酶标板上应加盖，或将酶标板平放在底部垫有纱布的湿盒中。 4.洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合物以及反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。一般应洗涤3~4次，每次3min。 5.应设空白对照、阴性对照及阳性对照。 * 1.包被 用0.05mol/L pH9.6碳酸缓冲液稀释豚鼠Anti-HBs至50μg／ml，然后将稀释好的豚鼠Anti-HBs用微量移液器加入反应板，每孔0.2ml，放湿盒内，置37℃温育2h，在转入4 ℃冰箱过夜。 2.洗涤 将包被液到掉后，用洗涤液（0.01mol/L pH7.4 Tris-Cl-Tween20溶液洗涤3次，每次持续3min。 3.加样 将待测血清用稀释液（0.01mol/L pH7.4PBS）稀释（从1：100、1：200至1：6400），然后用移液器分别加入1~7个孔，每孔0.1ml，第8孔加阳性对照血清，第9孔加阴性对照血清，第10孔加PBS做空白对照，将应用板置于37 ℃孵育2h。 4.洗涤 同步骤2. 5.加酶标记物 将酶标记豚鼠Anti-HBs加入反应板，每孔0.1ml，置37℃温育2h。 6.洗涤 同步骤2 7显色 每孔加显色液（临用前配制）0.1ml，置37℃作用15min。 8.终止反应 每孔加入2mol/L H2SO40.5ml。 待测孔A值-空白对照孔A值 阴性对照孔A值-空白对照孔A值 P/N= 当P/N≥ 2.1时判为阳性，以出现阳性结果的最高血清稀释孔的血清稀释度为该血清的（HBs-Ag）效价。 将反应板置酶标仪上测定各孔的光密度（A值或OD值），然后按下列公式计算，判断阴阳性结果。 *
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