芍药苷对K562细胞增殖的抑制作用及其机制研究.docVIP

精品论文 参考文献 芍药苷对K562细胞增殖的抑制作用及其机制研究 辛春雷1 李军1 王志效2（1山东省济宁市第一人民医院 272100；2济宁市中心血站 272100） 【中图分类号】R285 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）46-0200-02 【摘要】 目的 探讨芍药苷对K562细胞生长抑制作用及其对细胞周期的影响。方法　采用MTT法测定芍药苷对K562细胞的体外抑制作用，免疫细胞化学法检测凋亡相关蛋白bcl-2，流式细胞仪测定细胞周期。结果　芍药苷对K562细胞有抑制作用，可下调凋亡相关蛋白bcl-2的表达，阻止细胞周期于G1/S期。结论　芍药苷可明显抑制k562细胞生长，阻止细胞周期。 【关键词】 芍药苷 K562细胞 细胞周期 bcl-2 目前治疗血液恶性肿瘤的现代治疗技术在挽救患者生命，延长生存期等方面使患者获益匪浅。但同样放化疗的毒副作用，干细胞移植后生活质量的降低，使病人不能走向社会??也是需要解决的问题。中医药是一大宝库，许多中药对人体机能具有双向调节性，有多层次、多环节、多靶点的生物学效应。芍药苷是从中药白芍提取的物质，近年研究芍药苷（paeoniflorin）具有抗炎、免疫调节、保肝、镇静等作用[1-3]。 1 材料与方法 1.1 实验仪器与试剂 酶标仪；流式细胞仪；CO2孵箱。芍药苷；MTT；胎牛血清；DAB显色试剂盒；细胞免疫化学染色试剂盒SP-20002；bcl-2 单抗。 1.2 细胞系与细胞培养 K562常规培养传代细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。 1.3 体外药效学试验－细胞活性检测（MTT） 取对数生长期的K562细胞，传代接种于96孔板，每孔180mu;l（1times;105/孔），设置对照组（不加药）、空白组（只有培养基，无细胞）和5种浓度药物组（0.1、1、10、100、1000mu;gbull;ml-1），共分7组，每组设3个平行孔。在0、12、24、36、48、72h六个时间点，选择492nm波长在酶标仪上测各孔OD值，按下式计算细胞抑制率：IR%=（A对照－A实验）/A对照times;100%。 1.4 免疫细胞化学法检测bcl-2表达 用三个不同浓度的芍药苷（10mu;gbull;ml-1、20mu;gbull;ml-1、40mu;gbull;ml-1）处理细胞24小时，收集细胞，离心洗涤，丙酮固定，空气干燥；加3%过氧化氢去离子水处理标本10min；加山羊血清工作液50micro;l封闭，孵育；加一抗，37℃孵育2～3h；加生物素标记的第二抗体50micro;l，孵育10～15min；加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液50micro;l，孵育10～15min；加DAB溶液50micro;l，显色3～5min，显微镜下观察；如必要苏木素复染、1%盐酸酒精分化、1%氨水返蓝；乙醇逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片，显微镜下观察。 1.5 芍药苷对K562细胞周期的影响 用两个不同浓度的芍药苷（10mu;gbull;ml-1、20mu;gbull;ml-1）处理细胞12小时，将K562细胞用PBS洗涤，用20mu;gbull;ml-1的碘化丙啶（PI）溶液10mu;l在低温下染色20分钟，立即FCM检测。 1.6 统计学处理 采用统计软件SAS6.12进行分析，数据以均值plusmn;标准差表示，样本均数的比较用t检验。 2 结果 2.1 细胞活性检测（MTT） 芍药苷在浓度为20mu;gbull;ml-1时可出现细胞生长现象，且随时间的延长生长抑制越明显，具有时效关系(图1)。 图1 芍药苷与K562细胞共同孵育不同时间的细胞生长曲线 2.2 流式细胞仪检测K562细胞周期 芍药苷作用K562细胞12小时检测细胞周期，结果显示阻止细胞周期于G1/S期（表1）。 表1 芍药苷对K562细胞周期的影响 分组 浓度(ugbull;ml-1) G1前期 G0/G1期 S期 G2/M 期 对照组 － 2.60 40.23 27.25 17.32 药物组 10 5.84 16.12* 30.56* 35.29* 20 22.51 12.35* 28.41**