孢壁蛋白的研究.DOCVIP

附件2 论文中英文摘要格式 作者姓名：吴正理 论文题目：家蚕微孢子虫 (Nosema bombycis) 孢壁蛋白的研究 ——三种主要蛋白质成分的鉴定与克隆分析 作者简介：吴正理，男，1978年03月出生，2004年09月师从于西南大学向仲怀 教授，于2007年12月获博士学位。 中 文 摘 要 微孢子虫(Protozoan: Microsporidia)是一类细胞内专性寄生的单细胞真核生物，广泛寄生于无脊椎动物和脊椎动物，包括人类；是经济昆虫、鱼类、兔类、产毛动物、啮齿类及灵长类的常见病原。自19世纪发现家蚕微孢子虫以来，不断有新的种类被分离鉴定，目前已发现有超过150个属1 200多种。自1959年发现了微孢子虫感染免疫缺陷型病人后，相继发现8个属14个种感染人类，尤其是AIDS病人。由于微孢子虫与人类的健康密切相关，因此引起了科学界的广泛关注。微孢子虫曾一度被认为是缺乏线粒体的原始的真核生物，但近年来的研究表明微孢子虫归属于真菌类，而其经历了简化进化的过程才呈现出较原始的特征；同时实验证明了微孢子虫具有称之为“线体”的简化的线粒体细胞器。家蚕微孢子虫是微孢子属的典型种，普遍寄生于家蚕而引发家蚕微粒子病导致毁灭性病害，攻克微粒子病这一顽症，是蚕业界研究领域的重点和难点，但目前国内外有关家蚕微孢子虫的分子生物学研究极为薄弱，缺乏对家蚕微孢子虫的深刻认识。位于微孢子虫孢壁结构内的孢壁蛋白是微孢子虫最先、最直接地与宿主接触的部分，很可能在感染寄生宿主的过程中扮演着重要的角色，已成为研究热点。目前已报道的微孢子虫孢壁蛋白共有7种，且研究结果表明其参与到微孢子虫的侵染过程中，但其在微孢子虫侵染过程中的作用机制仍不清楚。家蚕微孢子虫孢壁蛋白的研究还处于探索阶段，基因的序列信息及基因的功能研究均未见报道，本研究首先在家蚕微孢子虫孢壁蛋白前期研究的基础上，优化了孢壁蛋白的提取方法，然后结合家蚕微孢子虫的全基因组数据以及蛋白质分析手段鉴定家蚕微孢子虫孢壁蛋白，旨在了解孢壁蛋白在家蚕微孢子虫生活周期内所起的作用，为家蚕微粒子病的防治进一步奠定研究基础并提供作用靶标。主要研究结果如下： 1．家蚕微孢子虫孢壁蛋白不同提取法与获得蛋白组分情况的比较研究。 蛋白质的提取方法与提取量一直是微孢子虫蛋白质研究的瓶颈之一。本研究系统地比较了家蚕微孢子虫孢壁蛋白的提取方法，并且通过孢子发芽后收集孢子空壳的方法获得孢壁蛋白，既丰富了微孢子虫蛋白质的提取方法，又充分控制了蛋白质的纯度。研究结果显示：不同的处理方法所提取的家蚕微孢子虫孢壁蛋白在数目及含量上都有很大的区别。SDS处理的孢壁蛋白有3条明显的主带，分子量28～35 kDa之间,其他条带非常弱。煮沸法处理的孢壁蛋白有5条明显的主带，分子量28～35 kDa之间，其中包括SDS处理的3条主带。不同浓度的KOH处理的孢壁蛋白也有很大的差异，其中0.1 mol/L KOH处理只有2条明显的主带，分子量大约在30～33 kDa之间，且包含于煮沸法处理的五条主带之中；而0.05 mol/L 和0.01 mol/L KOH处理的孢壁蛋白条数基本一致，但含量相差较大。Laemmli提取法以收集发芽后的孢子空壳为材料，既控制了孢壁蛋白的纯度又提高的蛋白质的丰度。从不同处理方法所得到的孢壁蛋白可以看出家蚕微孢子虫孢壁蛋白达到20～30种，其中有3种蛋白质含量极其丰富。 2．去孢壁蛋白状态下家蚕微孢子虫的形态类型分析 本研究综合利用显微镜技术对家蚕微孢子虫的外形、内部超微结构进行了系统的观察，并检测孢壁蛋白提取后孢子的形态完整性及超微结构的变化。家蚕微孢子虫个体形状各异，体积大小、极丝的圈数上也存在很大的差别(通常为11~14圈)，但多数呈椭圆形，表面光滑，具折光性。孢子发芽后极丝细长，具有方向不定性，发芽后的孢子空壳虽然凹陷但仍保持其完整性。被感染的家蚕胚胎细胞呈蜂窝状，感染后期细胞破碎，释放出大量成熟的孢子及二次感染体(短极丝孢子)；同时具有许多不同形状的孢子，如梨形孢子，可能是孢子处于不同的发育时期。在细胞感染过程中，孢子只存在于细胞质中，在细胞核中并无发现。通过显微镜技术观察处理后的孢子发现：不同方法处理后的孢子虽然在形态、大小等方面发生变化，但均能保持孢子的完整性，其超微结构也保持完整。发芽后收集的孢子空壳经镜检后发现99 %以上为孢子空壳，进一步证实了本研究所提的蛋白质为孢壁蛋白，为孢壁蛋白的研究提供了严谨的材料。 3．家蚕微孢子虫孢壁蛋白质组的初步研究。 本研究采用蛋白质组学的分析方法对家蚕微孢子虫孢壁蛋白进行了分析，共获得了14个假定的孢壁蛋白，其中LC-MS/MS获得了12个，MALDI-TOF-MS获得了10个，有8个蛋白在2种方法中均检索到，且其中7个蛋白质具有EST数据。从蛋白质样品的严谨性以及