猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）.doc

ICS11.220 B42 DB45 广西壮族自治区地方标准 DB 45/T XXXXX—2011 猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR） 点击此处添加标准英文译名 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2010年12月） 2011 - XX - XX发布 2011 - XX - XX实施 广西壮族自治区质量技术监督局发布 目次 前言 II 1　范围 1 2　术语和定义 1 3　材料准备 1 3.1　用于猪EMCV检测的特异性引物 1 3.2　试剂 2 3.3　仪器设备及耗材 3 4　操作方法 3 4.1　待检样品处理 3 4.2　待检样品总RNA提取 3 4.3　RT-PCR 4 4.4　注意事项 4 5　PCR 5 5.1　电泳 5 5.2　结果判定 5 附录A（规范性附录）　 6 附录B（规范性附录）　 7 附录C（规范性附录）　 8 附录D（资料性附录）　 10 前言 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种核酸体外扩增技术，应用该技术对猪脑心肌炎病毒进行快速鉴别检测具有重大意义。本技术规程在充分参考文献资料、经过实验室和生产应用验证的基础上制订的，适用于猪脑心肌炎病毒的检测。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准。 猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR） 范围 本标准规定了猪脑心肌炎病毒（EMCV）检测的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于猪脑心肌炎病毒的检测。 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 脑心肌炎病毒 encephalomyocarditis virus（EMCV） 脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)属于微RNA病毒科心病毒属的成员，其核酸为单股正链RNA，基因组核苷酸长度大约7.8 kb。EMCV可以引起某些哺乳动物、乃至灵长类动物以脑炎、心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。EMCV在猪主要以断奶仔猪的急性心肌炎、突然死亡以及母猪的繁殖障碍为特征。临床上仔猪表现为突然死亡、心肌变性、出血、呼吸困难，而母猪常无明显的临床症状或表现出严重的繁殖障碍。病猪的心脏、扁桃体、胰腺、脾脏、肠道及肠系膜淋巴结等均有肉眼可见的病变，其中以心内膜、心外膜和心室乳突上的灰白色条状或圆形坏死灶为其主要特征。 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR） PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA的方法。热变性→复性→延伸一个 PCR 循环经过次循环反应目的 DNA扩增。)。试剂盒包含了提取RNA所需的除1 %冰乙酸异丙醇以外的全部试剂： ——Solution A； ——Solution B； ——Rinse A； ——Rinse B； ——Spin column； ——Elution Buffer。 RT-PCR试剂盒 使用天根生化科技（北京）有限公司生产的Quant 一步法 RT-PCR 试剂盒)。该试剂盒包含RT-PCR一步法反应所需的全部试剂： ——10× RT-PCR Buffer； ——5× RT Enhancer Buffer； ——dNTP Mixture（10 Mm each）：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP； ——Rnasin（40 U/μL）； ——Hotmaster Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)； ——Quant RTase（for one step）。 DNA分子量标准 使用宝生物工程（大连）有限公司生产的DL2,000? DNA Marker)试剂。 电泳试剂 电泳试剂如下: ——1 ％琼脂糖； ——10 mg/mL溴化乙锭（EB）； ——凝胶加样缓冲液； ——1倍Tris-硼酸电泳缓冲液。 其他试剂 其他试剂如下： ——灭菌双蒸水； ——1 mol/L灭菌PBS，pH7.2； ——DEPC H2O。 注：各种试剂的配制方法见附录B。 仪器设备及耗材 仪器设备 本方法使用下列仪器设备： ——PCR仪； ——电泳仪； ——紫外线检测仪； ——凝胶成像系统； ——高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min以上）； ——小型高速离心机； ——水浴锅； ——旋涡振荡器； ——乳钵或玻璃研磨器； —— 微量加样器：100 μL～1 000 μL、20 μL～200 μL、10 μL～100 μL、 5 μL～50 μL、0.5 μL～10 μL和0.1 μL～2.5 μL等多种规格。 一次性耗材 本方法使用下列一次性耗材： ——乳胶手套； ——离心管：2 mL、1.5 mL和0.5