确定目的基因基因敲除基因表达目的基因的导入检测与筛选产物分析.PPT

核酸分子杂交检测法 基本原理：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜的温度及离子强度等的条件下，可按碱基互补配对的原则高度特异地复性成双链。杂交双方是待测的核酸序列和用于检测的已知片段。核酸分子杂交的检测法可分为Southern印记杂交、Northern印记杂交、菌落印记原位杂交、斑点印记杂交。 免疫化学检测法 使用抗体探针，而非DNA探针来鉴定目的基因的表达产物。 1.放射性抗体测定法 2.非放射性抗体测定法 3.免疫沉淀法 转录产物作图 如果DNA片段中的目的基因能够转录生成mRNA产物，通过对mRNA的分析，也可以间接鉴定重组DNA分子，对目的基因进行定位研究。 基因表达产物分析法 如果重组质粒的目的基因能顺利表达，那么只要能检测到该目的基因的蛋白质产物，就能说明该重组质粒含有目的基因。 DAN序列测定法 DNA序列测定，即核酸一级结构的测定，简称DNA测序。对克隆DNA片段进行序列测定及分析，不仅可以直观地鉴定出重组DNA分子中是否含有目的基因，也可以获得目的基因的编码序列和调控序列，这对目的基因的表达及其功能研究具有重要意义。 确定目的基因 基因敲除 基因表达 目的基因的导入、检测与筛选 产物分析 傅慧垚 刘亚洲 张君利 钟艾玲 郭森林 基本流程 产物分析 1、表达体系 2、基因表达过程 3、代谢产物分析 确定目的基因 基因敲除 基因表达 目的基因的导入、检测与筛选 产物分析 傅慧垚 刘亚洲 张君利 钟艾玲 郭森林 基本流程 1、表达体系 基因重组和克隆的最终目标通常是使克隆基因在宿主细胞中高效表达，以便获得表达产物从而为人们所利用。 当前各种先进的基因导入技术及细胞培养方法已成功实现外源基因在动物、植物和酵母等真核宿主细胞，以及原核细胞中高效表达。 1、表达体系 原核表达体系优点： ①无核膜，染色体是裸露的环形DNA，转录与翻译相偶联连续进行； ②表达以操纵子为单位，是数个相关的结构基因及其调控区构成一个基因表达的协同单位； ③一般无内含子，缺乏转录后加工过程； ④只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，基因表达控制主要在转录水平；真核有三种RNA聚合酶； ⑤mRNA上有核糖体结合位点，有SD序列，真核缺乏。 2、基因表达过程 2.1 转录 起始（initiation）:识别启动子，形成“泡”，以及mRNA合成开始 延伸（elongation）:“泡”沿着DNA迁移 终止（termination）:此时RNA转录物释放，“泡”关闭 转录终止子：（作用机制不同） ①一类在ρ因子的作用下使mRNA的转录终止； ②另一类根据DNA模版中的对称序列形成发夹结构而使新生的mRNA终止转录。 2.2 翻译 原核生物的转录和翻译是重叠进行的，在转录未完成时翻译已经开始。 1.翻译起始复合物的形成 2.细菌中肽链延伸的第一步反应：第二个氨酰-tRNA的结合 3.细菌中肽链延伸的第二步反应：肽链的生成 4.细菌中肽链延伸的第三步反应：移位 肽链的终止 释放因子（release factor,RF）：识别终止密码子并与之结合 Ⅰ类释放因子 识别终止密码子，并能催化新合成的多肽从P位点的tRNA中水解释放出来。（细菌：RF1、RF2） Ⅱ类释放因子 在多肽链释放后刺激Ⅰ类释放因子从核糖体中解离出来。（细菌：RF3） 2.3 基因表达调控元件 1 启动子元件 Pribnow型启动子：主要类型，-10区（TATAAT）也叫Pribnow框、-35区（TTGACA）也叫Sextama框两个相距17bp的保守区和 间隔区，能够被含有σ70因子的RNA聚合酶所识别。 Ntr型启动子：-12区、-24区，间隔区。能够被含有σ54因子的RNA聚合酶所识别。 2 增强子 增加启动子转录效率，用于构建新型高效表达载体，提高克隆基因在元和表达系统中的表达效率。 hylR增强子---作用原理，直接或间接导致DNA弯曲，以使调节蛋白更接近转录起始部位。（细菌溶血素基因质粒启动子phyⅠ，50倍） 3 终止子 本征终止子：不需要其他蛋白辅助。发夹结构和紧随其后的6个连续的U串。 依赖性终止子：ρ因子。 4 衰减子 利用原核生物转录与翻译偶联特性，依赖自身巧妙的特征序列和相应的RNA二级结构，对基因进行开关式微调作用，保证原核生物相关操纵子处于阻遏的状态下仍能以一个基底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等。 最先发现于，大肠埃细菌色氨酸操纵子，位于操纵基因与第一个结构基因tr