第十二章-植物种植资源的离体保存.pptVIP

超低温冷冻保存为什么没有把细胞冻死？ 细胞冰冻结冰保护性脱水理论 溶液的玻璃化理论 三、植物超低温冻存的细胞学基础 细胞冰冻结冰保护性脱水理论 常温下，细胞及其溶液处于渗透平衡的状态，当温度降到冰点以下时，首先是细胞外溶液部分“冻结”出冰；胞外溶液的浓度升高，破坏了细胞内外溶液的平衡，水分由胞内通过细胞膜向外渗透，细胞收缩，细胞内浓度提高；当温度不断降低时，冻结和渗透过程不断进行，这种过程称为保护性脱水。 当复温时，温度升高，冻结的冰不断融化，水分由胞外向胞内渗透，使收缩的细胞膨胀，可能恢复原状。 精确控制上述过程，能使细胞在降温、复温、渗透过程中不被损伤而死亡。 溶液的玻璃化理论 溶液在降温时，如果没有均一晶核或晶核生长缺乏足够的时间，就首先形成过冷溶液。继续降温，均一晶核形成。如果降温速度不够快，就形成尖锐的冰晶。降温速度足够快，均一晶核很少或几乎没有形成，或均一晶核生长缺乏足够的时间，溶液就进入无定型的玻璃化状态。它是一种透明的固态，与液态相比，分子没有发生重排，因此与晶态不同。被称为玻璃态，此时的温度叫玻璃化形成温度。在玻璃化形成过程中，既没有溶液效应对细胞的损伤，也没有冰晶的形成对细胞造成的机械伤害。 提高超低温冷冻保存的措施 由于植物细胞含水量比动物细胞高，冰冻保存难度大，如果直接将保存材料放入液氮中，组织和细胞由于细胞内水分结冰，引起组织和细胞死亡，因而，超低温保存的植物材料必须借助于冷冻防护剂(cryoprotectant)。 冷冻防护剂 防护机理： 在水溶液中能强烈地结合水分子，水合作用的结果使溶液的黏稠度增加。当温度下降时，溶液冰点下降，即冰的结晶中心增长速度下降，使水的固化程度减弱。因而对于降低培养基冰点和植物组织、细胞冰点起重要作用。 冷冻防护剂的使用提高了培养基渗透压，导致细胞的轻微质壁分离，相对提高了组织和细胞的抗寒力。 常用的冷冻防护剂 渗透型冷冻防护剂: 多为小分子中性物质，在溶液中易结合水分子发生水合作用，使溶液粘性增加，弱化水的结晶过程，达到保护的目的。 包括 二甲基亚砜（DMSO）（极易渗入细胞内部，可防止细胞在冷冻和融冰时，引起过度脱水而遭受破坏） 甘油 甘露醇 脯氨酸 乙二醇 丙二醇 非渗透型冰冻保护剂: 是聚合分子物质，能溶于水，但不能进入细胞，它使溶液呈过冷状态，从而起到保护作用。此类冰冻保护剂对快速、慢速冷却均有保护效果。 常见的： 聚乙烯吡咯烷酮(Polyvingyl pyrollidone, PVP) 葡聚糖(Dextrane) 聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG) 羟乙基淀粉(Hydroxyethyl starch, HES) 四、超低温保存的方法 超低温保存的基本操作程序为： 选择适宜年龄和生长状态的冷冻材料； 对生物材料进行预处理，提高分裂细胞的比例和减少细胞内自由水的含量，使材料达到最适生理状态； 将材料装入试管或其他保存容器中，放入冰浴中； 在冰浴条件下加入0℃预冷的冷冻保护剂，冰浴放置30～45min； 采用不同的降温冰冻方式进行冷冻，直至最后放入液氮中，并在液氮中停留至少1h； 保存后的化冻，一般采取在37～40℃温水浴中快速化冻； 材料化冻后的活力鉴定，进行再培养，观察恢复生长的速度及植株的再生能力，分析冻后材料或再生植株的遗传性状。 1. 材料的选择和预处理 由于植物的基因型、抗冻性以及器官、组织和细胞的年龄、生理状态等因素对超低温保存的效果有较大的影响。 一般来说，体积小、细胞质稠密、无液泡、薄壁的小分生细胞的存活率高于含大量液泡的大细胞；茎尖生长点、愈伤组织等培养物，解冻后只有具有上述特征的细胞才能存活。而较大的植物材料，如茎尖、胚或试管苗等，由于高度液泡化的细胞易受损伤，冷冻后只有分生细胞能够重新生长。 为了使保存材料达到超低温保存所要求的生理特性，还要对材料进行预处理，总的原则是提高细胞分裂与分化的同步化，减少细胞内自由水的含量，增强细胞抗寒力。 目前主要有3种预处理方式： （1）低温锻炼 激活植物体内抗寒机制 （2）继代培养 增加有丝分裂细胞数目 （3）预培养 培养基中加冷冻保护剂或诱导抗寒力物质 2. 冰冻方法 降温冰冻方法是影响超低温保存效果的关键因素之一。 （1）快速冰冻法 将材料从0℃或预处理温度直接投入液氮，其降温速度在1000℃/min以上。这个过程可以使细胞内的水分子还未来得及形成结晶中心就降到了-196℃的安全温度，从而避免了细胞内结冰的危险。此法适用于那些高度脱水的材料，如种子等。 （2）慢速冰冻法 采用逐步降温的方法，以0.5～2℃/min的降温速度，从0降到-30℃，-35或-40℃，随即投入液氮，或者以此降温速度连续降温到-196℃。逐步降温过程可以使细胞内水分有充足的时间不断流到细胞外