拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的 转化.pptVIP

拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的 转化;引言 miRNAs是一类内生、非编码蛋白长度约为21--24个核苷酸的单链小分子RNA，在生物体内起着基因转录后的调控作用。 成熟的miRNA先于一种叫RISC的复合物接合，引起靶mRNA的降解；而当mRNA与靶mRNA不完全互补时，mRNA则通过与对应的靶mRNA的3’端非翻译区（3’UTR）结合阻止其转录后的翻译。 植物中的miRNA与其靶mRNA具有高度的碱基互补性，因而植物miRNA可能更像sRNA的作用方式对靶基因进行降解。;引言 作为重要的调解分子，miRNA参与生命过程中一系列的重要进程，包括生长发育、信号转导、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、肿瘤发生等。 也有一些研究报告指出，miRNA在调解植物对环境胁迫如干旱、盐害和养分胁迫反应等方面起着重要的作用。;引言 油菜作为一种重要的油料和经济作物，在硫的吸收、转运及代谢中同样需要硫转运体和ATP硫酸化酶的协助。 本实验采用PCR方法从拟南芥中克隆到了mR395d前体基因，并构建了过表达载体，通过采用根癌农杆菌介导法将mR395d前体基因导入甘蓝型油菜特选4号中，目前已获得了转基因植株。;一、材料与方法 １. 材料 拟南芥，甘蓝型油菜品种特选4号，大肠杆菌DH5A，农杆菌菌种EHA105，表达载体质粒pCAMBIA 1304。rTaq 酶, dNTP, 限制性内切酶。 ２.方法 １）拟南芥DNA的提取 　 用CTAB 法[ 13] 从幼嫩的拟南芥叶片中提取DNA。 ２）拟南芥m iR395d前体基因的克隆 参照拟南芥m iR395d 前体基因序列设计引物, 为了便m iR395d过表达载体的构建, 在上游引物的5c端加入Bglò酶切位点, 下游引物5c端加入了Sp e?酶切位点, 以拟南芥DNA 为模板, PCR 扩增466 bp左右的m iR395d前体基因。;材料与方法 ３）PCR产物的回收与测序　 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒回收后与克隆载体pMD19 TV ecto r连接, 转化大肠杆菌DH5A感受态细胞, 在含有IPTG、X-gal和Amp的LB平板上挑选单克隆。 其中：ＩＰＴＧ—— 　　　Ｘ－ｇａｌ 　　　Ａｍｐ 　　　ＬＢ;材料与方法;过表达载体构建的原理和步骤： 原理：将外源基因片段与载体连接（载体通常选用质粒或者噬菌体或其他病毒），将重组的载体转染受体细胞，使之整合入宿主基因组或者在稳定存在于胞质内，是宿主细胞能够表达载体上的外源基因，从而获得新性状或者新产物。 步骤： 1）从基因组或cDNA上克隆得到完整的目的基因（至少包含CDS区），通常在两端加粘性末端或重组位点； 2）选择合适的表达载体（真核、原核、噬菌体、某些病毒、标记等）； 3）将克隆得到的目的基因与载体连接； 4）将重组载体通过某种手段转入受体，即宿主中（化学转染、脂质体、电转、显微操作等）； 5）筛选阳性的宿主细胞并扩繁。;材料与方法 ５）根癌农杆菌介导法转化油菜 　　　　　 无菌苗培养: 选取籽粒饱满的油菜种子用70%乙醇表面消毒30 s,再用1 克每升 HgC l2 消毒5m in, 无菌水冲洗5次, 接种于种子萌发培养基(MS) 上, 置25 。Ｃ光照培养箱中, 每天光照12 h。 预培养: 待无菌苗长至第7天[ 14] , 分别切取子叶和下胚轴为转化的外植体, 置于预培养基(MS+2 mg／L- 6 BA + 0．1mg／ L- 2, 4 D, pH 6．２) 中, 黑暗预培养3 d。;材料与方法 农杆菌对外植体的侵染与共培养: 将含pre-miR395d过表达载体的农杆菌接种于LB + 20 mg／ L Rif+ 50mg／ L Kan液体培养基中( 5 mL), 28 。Ｃ 振荡培养过夜, 再转入40 mL新鲜的上述液体培养 　基中振荡培养3~ 5 h, 当菌液处于对数生长期(D 600为0．3~ 0．4) 时6 000 r／ m in离心5 m in, 　弃上清液, 加入5倍体积的MS液体培养基悬浮菌液备用。将预培养3 d的外植体浸入侵染液中, 子叶 　浸泡5m in, 下胚轴浸泡30 s, 用滤纸吸去多余液体, 紧密排列在MS固体培养基中, 黑暗培养2 d。;材料与方法 脱菌培养和筛选培养: 将共培养2 d的子叶和下胚轴转移至脱菌培养基(MS+ 2 mg／ L 6 BA +0．1mg／ L NAA + 6mg#／L A gNO3 + 50 mg／ L Timent in, pH 612)中, 6 d后转入筛选培养基(MS+ 　2 mg／ L 6 BA +