第二章培养基PPT.ppt

;第二部分内容：;第一部分：动物细胞用液的制备;;配液前准备：;离子交换水：;双蒸水、三蒸水：;超纯净水：;（二）、平衡盐液体（Balanced salt solution, BSS） ：;平衡盐液体：;PBS（Phosphate-Buffered Sallines） ;D-Hanks’ 平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt Solutions, D-HBSS);（三）、消化液——分散组织、细胞;● 使细胞间的蛋白质水解、细胞分散培养细胞传代。 分离组织、细胞团消化所需时间和浓度与细胞特性相关 特点： 1、胰蛋白酶的活力用解离酪蛋白的能力来表示，常用的有1：125和1：250两种。 2、许多学者认为钙、镁离子和血清的存在都会降低胰蛋白酶的活力。消化细胞时，加入一些血清（10%）或含血清的培养液，能终止消化作用。;称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-Hanks 平衡盐（或PBS）溶液调成糊状，再补足D-Hanks 平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温4 小时或冰箱过夜，不断搅拌振??? 次日，过滤除菌，分装入瓶中， -20℃保存备用（以免分解失效），常用浓度为0.25% （0.1%-0.5%）。 如果短期内要使用，就放置4℃冰箱。;EDTA·4Na 溶液：; 联合使用： 胰蛋白酶和EDTA联合使用可提高消化效率(细胞与细胞之间的粘附分子需要Ca2+: cadherin, selectin, integrin). 但需注意EDTA不能被血清中和，消化后要彻底清洗，否则细胞易脱壁。 ; 联合使用： 常用的配制方法（0.25%trypsin-0.04%EDTA溶液）： 胰蛋白酶0.25 g，EDTA0.04 g，PBS(-)液100 mL，烧杯内磁力搅拌充分溶解，0.22μm滤膜正压过滤，-20℃冰箱保存。 ; 消化细胞间质，分离上皮细胞与胶原成分。 根据细胞类型选用不同型号胶原酶（Ⅰ-Ⅳ）。 新鲜配制、 37-38oC作用、时间控制。 EDTA不可与胶原酶联用，因胶原酶的消化作用依赖于钙。 附：细胞外基质成分有胶原、纤粘蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）、弹性蛋白等） ;（四）、pH 调整液：;（五）、HEPES溶液：;（六）、谷氨酰胺补充液：;;（七）、酚红：;七、酚红：;（八）、抗生素溶液：; 抗生素溶液 通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 青霉素主要是对革兰阳性菌有效，链霉素主要对革兰阴性菌有效。加入这两种抗生素可预防绝大多数细菌???染。 培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位 ;抗菌素液（青、链霉素： ）：;三、培养基;合成培养基：;;● 种类 根据细胞特性选择（文献） 199——成分复杂，不常用；改良为109效果较199好 Eagle系列——MEM（Eagle最低必需培养液） BMEM（氨基酸改良） DMEM（增加成分）：高糖、低糖 RPMI1640——常用、悬浮细胞、多种细胞 Ham——F12：加微量元素等，可少用血清 单细胞、克隆化培养，无血清培养;细胞培养基应用选择：;RPMI1640种类;DMEM细胞培养基;干粉培养基的配制 ;合成培养基的配制 ：; 步骤：;;;;一、牛血清在细胞培养中的主要功能：;二、牛血清的主要成份;三、牛血清的利与弊：;四、灭活与分装过程：;3、血清中的沉淀物;4、牛血清分装：;● 无血清培养基——排除血清成分对细胞的影响 用于要求较高的研究，制备细胞因子、单抗等 础培养液 例：HamF12：DMEM=1：1 或McCoy’s 5a培养液 ;辅助成分:;细胞用液的分装方法和要求: