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高级生化及分子生物学-实验内容
2013-4-15中午，记录表达结果并拍照 第一天 课程说明及实验准备 上午：课程说明及分组 配试剂、培养基、灭菌； 下午14：00，倒平板； 枪头，试管等液体培养基灭菌 LB固、液体培养基配方（按1L计算） Tryptone 10g (1%) Yeast Extract 5g (0.5%) NaCl 10g (1%) 加蒸馏水溶解，用NaOH调pH值至7.0，定容到1000ml。 固体培养基加琼脂粉浓度为1.5% 高压灭菌（121℃/20min)，然后4℃放置备用。 单人操作，每人一种荧光蛋白 LB 平板：Kana抗性，3块 ，25ml/板 LB试管：3ml，7个 3月20日下午17:00，接种 第二天 提质粒 PCR 电泳（照相！）；回收PCR产物 酶切： PCR产物酶切； pET28a载体酶切； 5. 酶切产物的回收（电泳，照相），连接（注意标记清楚！），O/N 6. 接种DH5?，为制感受态细胞做准备 微量移液器的使用： 在开锁状态下使用！ 实验结束后，调回最大量程！ 实验过程中的废物放入塑料小蓝盆中，实验结束后倒到垃圾桶中！ 上海生工质粒抽提试剂盒 RFP-F(EcoRI): 5’-CG GAATTC ATG GTG CGC TCC TCC AAG AAC-3’ RFP-R(XhoI): 5’-CCGCTCGAGCTACAGGAACAGGTGGTGGCG-3’ PCR primer PCR反应条件： 第一步：94℃ 4min 第二步：94℃ 30s 第三步：55℃ 30s 第四步：72℃ 1min15s 第五步：72℃ 8min 第六步：16℃ 5min 重复第二步到第四步30次。 PCR反应体系及条件 10X Taq buffer 5ul 25mM MgCl2 4ul 2.5mM dNTP 4ul Primer1 (5umol/L) 1ul Primer2 (5umol/L) 1ul 模板DNA 1ul Taq酶 1ul ddH2O 33ul 50ul 注 意 酶切体系需要BSA，提供的是10X 限制性内切酶：Biolabs EcoRI，XhoI 酶切体系举例： plasmid ? ul 10 x buffer 4 ul 10 x BSA 4 ul Enzyme1 1 ul Enzyme2 1 ul H2O ? ul pET28a plasmid：10 ul PCR product: 15 ul 40 ul Total Set up ligation reaction DNA Ligation Kit，Ver 2.0 Code D6022 （TaKaRa） 连接反应体系为10ul，依次加入以下试剂 (切记：冰上操作！)? Vector fragment 1 ul Insert fragment 4 ul Solution I 5 ul Total Volume 10ul 轻轻混匀，离心片刻, 16℃连接
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