水稻XIOsPR10蛋白的原核表达及其RNase活性研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（７）：３９４２ 水稻ＸＩＯｓＰＲ１０蛋白的原核表达及其 ＲＮａｓｅ活性研究 郭迟鸣　毛　倩　王丽娟　李东霄　杨晓坡　郭立佳　汪　卫　李　敏　郝国静　陈　亮 （厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室　厦门　３６１００５） 摘要　ＰＲ１０（病程相关蛋白１０）类蛋白与植物的抵御外来病害及系统获得性抗性（ＳＡＲ）有着紧 密联系，而且许多ＰＲ１０类蛋白都具有ＲＮａｓｅ活性，并通过这种活性抵抗外源病害。根据获得的 ＸＩＯｓＰＲ１０基因，将其构建到ｐＥＴ２８ａ中，通过原核表达及磁珠纯化获得目的蛋白，通过 ＲＮＡ消化 实验证实ＸＩＯｓＰＲ１０重组蛋白具有ＲＮａｓｅ活性，进一步揭示了ＸＩＯｓＰＲ１０蛋白的功能。 关键词　防御　ＰＲ１０类蛋白　ＲＮａｓｅ酶活性 中图分类号　Ｑ７８９ 　　ＰＲ１０（病程相关蛋白１０）类蛋白是一类分子量在 １　材料与方法 １６～１９ｋＤａ的酸性蛋白。在大豆，苜蓿，马铃薯，棉花， 水稻等许多植物中都含有ＰＲ１０蛋白。ＰＲ１０蛋白的表 １．１　材　料 达与植物系统获得性抗性反应（ＳＡＲ）有着紧密的联 　　Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５、ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株，ｐＥＴ２８ａ（＋）质粒 α 系，在很多植物对病原菌的防御反应中ＰＲ１０类蛋白都 （本实验室保存）。其他酶及生化试剂购于上海生工、 ［１２］ ＴａＫａＲａ等公司。 有转录表达活性 ，而且在人参 ＰＲ１０蛋白的研究中 ［３４］ １．２　方　法 发现，ＰＲ１０蛋白与ＲＮａｓｅ具有序列的同源性 ，在随 后的研究中人们相继在白桦，棉花，胡椒，花生等植物 １．２．１　序列分析　将获得的ＯｓＰＲ１０ｃＤＮＡ序列翻译 中发现了 ［５１０］ 后，通过ＤＮＡＭＡＮ软件进行蛋白序列保守性分析。 ＰＲ１０蛋白的ＲＮａｓｅ活性 。 　　目前在水稻中人们已经发现了六种 ＰＲ１０类蛋 １．２．２　引物设计　根据ＸＩＯｓＰＲ１０基因序列，设计引 白［１１１４］，其中 ＪＩＯｓＰＲ１０已经被证实具有 ＲＮａｓｅ活 物。引物序列如下 ［１５］ 　　ＯｓＰＲ１０ＦＥ：５′ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＣＣＧＧＴＣ 性 。而其他的ＰＲ１０类蛋白尽管证实在病原菌侵染 或其他非生物性胁迫作用（干旱，盐胁迫等）下具有转 ＡＧＣＡＴＣ３′ 录活性，但它们是否同样具有 ＲＮａｓｅ活性仍未得到证 　　　　　　　　　　　ＥｃｏＲⅠ ［２］ 　　ＯｓＰＲ１０ＲＮ：５′ＧＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＴＴＴ 实 。 　　通过对水稻细菌性条斑病病菌感染后的差异蛋白 ＡＡＧＣＡＴＡＣＴＣＧ３′ 质组的分析，得到了感染后表达上调蛋白ＰＲ１０，获得了 　　　　　　　　　　　　ＮｏｔⅠ ＸＩＯｓＰＲ１０基因，对该蛋白基因进行了原核表达和纯化 １．２．３　原核表达载体ｐＥＴ２８ａＸＩＯｓＰＲ１０的构建　以 后的融合蛋白的ＲＮａｓｅ活性分析。 水稻ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增ＸＩＯｓＰＲ１０基因，ＰＣＲ体 系为：１０×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２ｌ，上下游引物各０．２５ｍｏｌ／Ｌ， μ μ