分子生物学常用技术下.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * -have to know location of oligos to analyse code -walk through movie SLOWLY * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * (5)抗原表位的鉴定与分析方法 抗原和抗体的识别与结合是最典型的蛋白质之间的相互作用 对位：指抗体参与结合的部位 表位：指抗原参与结合的部位 鉴定方法：计算机软件对抗原氨基酸序列的结构分析，准确率达 75％，包括亲水性、可及性、抗原性、可塑性、电荷 分布和二级结构预测分析。 实验方法：酶促/化学裂解片段分析法、蛋白质印迹法、肽扫描、 表面呈现肽库/随机片段表达库筛选、化学修饰/突变 分析、X射线衍射、表面等离子共振和核磁共振等。 应用：合成多肽疫苗、制备诊断试剂和筛选高效价抗体；利用定 点突变技术改造蛋白质结构以降低蛋白质药物免疫原性。 5.基因表达谱和表型变化 基因表达差异 蛋白质水平：双向凝胶电泳和质谱技术 基因芯片技术(主流) 代表性差异分析 抑制性减法杂交技术 mRNA减法杂交技术 基因表达系列分析法 基因组错配筛选技术。 表型变化 抑制基因的表达：反义寡核苷酸、核酶、 负显性突变体、转基因、RNAi 增强基因表达：即功能增益，增加基因拷贝数或 采用强启动子促使基因过量表达。 RNA水平 六、组学研究技术 1.基因组学 转录组分析：即mRNA的定性和定量分析， 分类：杂交法、PCR法和测序法 。 基因组：指一个单倍体细胞的所有DNA组成，或者一个 双倍体细胞DNA组成的一半。 基因组学领域：DNA测序、在物种内进行基因组多样性的 采集及其基因转录调控的研究。 2.蛋白质组学 概念：指在不同生理或病理条件下，对生物体、组织、 细胞内蛋白质存量的鉴别和功能特点分析。 方法：分离：蛋白质双向电泳 鉴定：质谱 分析：蛋白质芯片 蛋白质-DNA/蛋白质-蛋白质的相互作用 蛋白质双向电泳 电泳：第一向: 等电聚焦（IEF） 第二向: SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 染色：确定差异点蛋白质 PCR产物 A-T克隆 测序 重组表达载体 重 组 蛋 白 制备抗体 转 染 细 胞 原核表达载体 哺乳动物细胞表达载体 病毒表达载体 昆虫表达载体 酵母表达载体 检测活性 体内、体外 作用机制 应用 思考题： Fig1 2. Fig2是PCR结果，每个泳道的模板不同，你如何改进PCR条件 使得A、B、C和D样品能得到特异性好的目的条带？ Fig2 A B C D + - 1.你如何评价PCR电泳结果(Fig1)？为什么？如有问题如何解决？ Fig1 3. 你用热激法将连接产物转化到细菌中，LB-Amp平板没有 克隆，请分析可能的原因。 4. Western-blot实验中的影响因素有哪些？如果你得到的是 没有任何条带的白板，你准备怎么办？ 5 对本课程的意见和建议。 12月24日前交思考题作业 实验 XXX 设备：加样器 耗材 试剂和配制方法：详细 步骤：