分子生物学常用技术上.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 左下角处有超级链接到配伍末端 * * * * * * * * -mention all the ingredients necessary, how you can make ds cDNA for genomic libraries * -use EcoRI methylase to protect cDNA from degradation by EcoRI -T4 ligase can add together blunt ends * * * * * PCR传奇－－一个生物技术的故事。 保罗·拉比诺著，朱玉贤译。上海科技教育出版社， 1998。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。 Bam HⅠ Bg lⅡ GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGA G CCTAG GATCC G + + A TCTAG GATCT A T4DNA连接酶 16℃ 12h 4℃ 12h 室温 15min 连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DNA用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 Eco RⅠ切割位点 Bg lⅡ切割位点 + EcoRⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 Eco RⅠ+ Bg lⅡ 双酶切 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。 不同限制酶切位点的连接 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 平端连接 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ CCGAATTCG GGCTTAAGC 5′- 3′- Eco RⅠ 人工接头 α互补现象 pUC系列质粒 (lac操纵子) β-半乳糖苷酶氨基端 细菌 (β-半乳糖苷酶氨基端缺陷型) 蓝色菌落 外源DNA插入 白色菌落 β-半乳糖苷酶 诱导物IPTG 生色底物X-gal 缺陷型 蓝白筛选 a. 大量扩增目的核酸片段 b. 检测基因的整合、表达情况 c. 在核酸中引入突变 d. 核酸测序 e. 克隆新基因 f. 生物多态性的研究 应用 医学领域 a. 疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 b. 致病病原体的检测 c. 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 d. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 e. 其他：动、植物检疫（转基因动植物检测） 长片段PCR Taq酶：LA Taq酶( 5U/ 50μl反应) dNTP: 2.5mM 8 μl 延伸：5min 循环：25 λ-HindⅢ 第一轮PCR 巢式PCR: 模板数低，增加特异性扩增，提高扩增效率。 需要两到三对引物 1 2 第二轮PCR 3 4 3 2 1 4 反转录PCR：RE-PCR，略 b. 当突变位于基因的中间部位时，可以采用以下方法。 研究蛋白质结构与功能之间复杂关系的重要工具。 定点突变： a. 突变位点位于基因两侧，在引物中加突变碱基； 2 1 1 3 第一轮 PCR 第二轮 PCR 方法一 1 2 3 4 1 4 方法二 第一轮分步PCR PCR产物互补 Taq酶 第二轮PCR 定量PCR 普通PCR：对终产物进行定性和半定量分析； PCR 产物的长度从100bp～数kb。 定量PCR：实时检测每个循环扩增产物量的变化； 通过Ct值和标准曲线对起始模板定量分析； PCR产物长度一般在 60～150 bps。 log[DNA] 不同样品有不同的生成曲线 非特异性：SYBR Green：与DNA双链的小沟结合，双链时 有荧光，单链时无荧光。 特异性：Taq man：