分子生物学培训总结.pptVIP

DNA的结构及功能 DNA分子是由两条反向平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。 DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排在内侧。 两条链的碱基通过氢键连接形成碱基对，其中A与T配对，G与C配对。 两个相邻脱氧核苷酸通过3’ -5’磷酸二酯键连接。 起着贮存和传递遗传信息的作用。 RNA的种类Category 转运核糖核酸(transfer RNA, tRNA) 核蛋白体核糖核酸(ribosome RNA, rRNA) 信使核糖核酸(messenger RNA, mRNA) 转运氨基酸 与蛋白质结合形成核蛋白体,起装配机的作用 翻译蛋白质的模板 真核生物的结构基因由内含子和外显子组成，内含子的序列较长，且不编码蛋白质。 真核生物DNA在转录过程中经剪接可将内含子部分去除，获得成熟的mRNA。 由于分子生物学研究的最终产物常常是蛋白质，因此我们需要获得可翻译的mRNA。 mRNA易降解，不易长期保存。 将mRNA逆转录成cDNA，利用cDNA来研究基因的功能。 Trizol提取RNA原理 Trizol法提取细胞总RNA是目前常用的提取方法。 细胞内大部分的RNA与蛋白质结合在一起，以核蛋白形式存在。 Trizol内含异硫氰酸胍和苯酚等物质。 异硫氢酸胍(GuSCN)是一种强的蛋白质变性剂，不仅能使细胞裂解，同时还能有效地抑制细胞内源性RNA酶的活性。 通过有机溶剂的分步抽提，最终可获得纯度较高的细胞总RNA。 RNA提取注意事项 Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。如皮肤接触Trizol，请立即用大量水冲洗。 RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注意随时勤换手套，样品尽可能盖严；尽量不要对着RNA样品呼气或说话。用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后灭菌，烘干。溶液需用DEPC水配制。 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。 逆转录(Reverse Transcription) 逆转录指遗传信息从RNA流向DNA， 是RNA指导下的DNA合成过程，即以RNA为 模板，四种dNTP为原料，合成与RNA互补的 DNA单链，称为互补DNA ( complementary DNA, cDNA) 逆转录原理 cDNA合成有两个关键因素，一是病毒RNA的质量，二是逆转录酶。 逆转录酶是一种多功能酶，它能在一定的条件下，以单链RNA为模板合成第一条cDNA链。 通过RNaseH活性水解RNA-DNA杂合分子中的RNA链。 逆转录酶(reverse transcriptase) 催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA 病毒中都含有此酶。 具有三种酶活性： RNA指导的DNA聚合酶 RNA水解酶活性 DNA指导的DNA聚合酶 逆转录体系 RNA模板—— 3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA 5’ 逆转录过程中cDNA的合成 逆转录引物的选择(Primer) Oligo(dT)(12-18个核苷酸组成），只有mRNA被逆转录 随机六聚寡核苷酸，所有RNA均被逆转录 基因特异性引物，仅产生需要的DNA 逆转录的生物学意义 扩充了中心法则 有助于对病毒致癌机制的了解 与真核细胞分裂和胚胎发育有关 逆转录酶是分子生物学重要工具酶 PCR基本原理 利用高温可使DNA变性和低温可使DNA复性的特性，根据体内细胞分裂中DNA半保留复制机理，以特异性寡核苷酸为引物， DNA分子为模板，在DNA聚合酶和四种脱氧核苷酸存在的条件下体外合成新DNA分子的过程。 这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 PCR技术的特点 高度的敏感性 高度的特异性 操作简便、快速 适用样品的广泛性 PCR基本成分 template primers Taq polymerase 10×PCR buffer dNTPs Mg++ PCR Primers 引物设计(Primer design) 引物长度（length）: 20～30bp 引物中四种碱基的分布应该是随机的 两引物间不能有互补序列，尤其是3‘端 引物的碱基顺序不应与非扩增区域由同源性 引物的3’末端碱基一定要与模板DNA配对 可以在5’末端加上限制性内切酶位点或起始密码 解链温度(Tm)：两引物间相差不大于5℃ 引物内部不能有大于3bp的反向重复序列或自身互补序列存在 PCR基本程序 预变性（Pre-denaturation) 变性(Denaturation) 退火(Anneal