重组结核杆菌热休克蛋白Acr2的原核表达纯化及鉴定-自然资源学报.PDFVIP

热带病与寄生虫学２０１７年第１５卷第３期 ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｒｏｐｉｃａｌＤｉｓｅａｓｅｓａｎｄＰａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ２０１７Ｖｏｌ１５Ｎｏ３ ·１３１· ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１６７２—２３０２２０１７０３００２ ·论著 · 重组结核杆菌热休克蛋白Ａｃｒ２的原核表达、 纯化及鉴定的研究 陈勇　陈竹　张奇声　左益亮　张灿　李子昂　陈乔　夏惠 【摘要】目的 原核表达、纯化结核杆菌热休克蛋白Ａｃｒ２分子，并分析其免疫反应性。方法 采用ＰＣＲ 法扩增结核杆菌Ａｃｒ２基因，并构建重组表达质粒 ＰＥＴ２２ｂ－Ａｃｒ２，转化大肠埃希菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株，并用 ＩＰＴＧ诱导Ａｃｒ２蛋白表达。以及使用镍离子亲和层析柱纯化该表达产物，并通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测其免疫反 应性。结果 ＰＣＲ、双酶切和测序结果均表明ＰＥＴ２２ｂ－Ａｃｒ２重组质粒构建成功，其在大肠埃希菌中主要以 包涵体蛋白形式进行表达。复性后的包涵体蛋白经镍离子亲和层析柱纯化后，可获得纯化的Ａｃｒ２重组蛋 白，该重组蛋白分子质量约为１８．３ｋｕ，与结核分枝杆菌Ａｃｒ２蛋白的理论预测值相符。经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测 显示该重组蛋白能被结核病人血清特异性识别。结论 原核表达质粒ＰＥＴ２２ｂ－Ａｃｒ２被成功构建，以及Ａｃｒ２ 重组蛋白被有效进行表达和纯化，从而为进一步研究其生物学功能奠定了基础。 【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白；Ａｃｒ２；原核表达；纯化 Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｅａｔｓｈｏｃｋｐｒｏｔｅｉｎＡｃｒ２ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕ １，２ １ １ １ １ １ １ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＣｈｅｎＹｏｎｇ ，ＣｈｅｎＺｈｕ，ＺｈａｎｇＱｉｓｈｅｎｇ，ＺｕｏＹｉｌｉａｎｇ，ＺｈａｎｇＣａｎ，ＬｉＺｉａｎｇ，ＣｈｅｎＱｉａｏ，Ｘｉａ １，２ Ｈｕｉ ．１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ，ＢｅｎｇｂｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ．Ｂｅｎｇｂｕ２３３００３，Ｃｈｉｎａ．２．ＡｎｈｕｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆ ＩｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄＩｍｍｕｎｉｔｙ，ＢｅｎｇｂｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ．Ｂｅｎｇｂｕ２３３００３，Ｃｈｉｎａ． ＣｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇＡｕｔｈｏｒ．  【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｆｙｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎＡｃｒ２ｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｙｉｔｓｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＡｃｒ２ｇｅｎｅｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓ ＰＥＴ２２ｂ－Ａｃｒ２ｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｅｌｌｓ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉ ｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｉｎｄｕｃｅｄｗｉｔｈＩＰＴＧ．ＴｈｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｅｒｅｐｕｒｉｆｉｅｄｗｉｔｈＮｉ－ＮＴＡａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａ ｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｌｕｍｎ，ａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏ ｔｅｉｎＡｃｒ２．ＲｅｓｕｌｔｓＰＣＲ，ｄｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ ＰＥＴ２２ｂ－Ａｃｒ２ｗａｓｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｐｒｉｍａｒｉｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｉｎＥ． ｃｏｌｉ．ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＡｃｒ２ｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｈｅｒｅｎａｔｕｒｅｄｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｔｈａｔｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ－ＮＴＡａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ