利用MTT法测定5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果.doc

利用MTT法测定5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果 摘要：目的：研究5-氟尿嘧啶对Hela细胞增殖的抑制效果。方法：应用MTT法分析不同浓度的5-氟尿嘧啶（5-Fu）对Hela细胞增殖的抑制效果。结果：随着5-氟尿嘧啶浓度的逐渐增加，OD值逐渐减小；由细胞增殖抑制率计算公式可以得出不同浓度的5-氟尿嘧啶对Hala细胞的增殖抑制率分别为：-63.09％、-70.74％、-74.50％、-76.78％。结论：① OD值的变化间接的表明5-氟尿嘧啶对Hala细胞增殖确实有抑制作用，抑制的效果为：50 ug/ml＜100ug/ml＜200 ug/ml＜400ug/ml；②随着5-氟尿嘧啶浓度的增大，细胞增殖抑制率随之增高。 关键词：MTT法 5-氟尿嘧啶 Hela细胞 增抑制 使用任何抗肿瘤药物都有的潜在风险,理想的抗肿瘤药物应是确保对正常组织起选择性保护作用,又能最大限度的杀死癌细胞，目前研究表明，5-氟尿嘧啶对正常组织的保护作用是肯定的,但是对于肿瘤细胞的抑制作用尚不能完全确定。为此进行本次实验以检测不同浓度5-氟尿嘧啶对癌细胞的抑制效果。 1.实验原理 1.1 MTT法作用原理 MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。 MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色（或蓝色）结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中；在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，因此用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。 MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。同时，利用已知浓度细胞培养后的吸光度可以生成细胞生长趋势曲线，通过该曲线可推测出某一未知浓度细胞的原始接种浓度。 1.2 5-氟尿嘧啶抑制癌细胞生长原理 恶性肿瘤患者由于肿瘤细胞无止境地分裂、增殖而不断地消耗宿主的营养物质，以及宿主因荷瘤状态所存在的代谢紊乱，机体常存在不同程度的营养不良，严重者导致恶液质，体质下降。5-氟尿嘧啶能够抑制癌移植瘤的生长并诱导瘤细胞的凋亡。5-氟尿嘧啶能选择性地攻击DNA碱基的氮原子，特别是鸟嘌呤的第7位氮原子，和胞嘧啶的第3位氮原子结合。由于和DNA呈交叉联接，对DNA的构型有明显影响，使双螺旋解旋使分子变短；可与DNA形成链内交联，也可形成链间交联或DNA-蛋白质间的交叉联结，由于其可使DNA的模板作用失活，从而抑制DNA合成而抑制肿瘤的生长。 2.实验材料和方法 2.1 实验材料 海拉细胞系（HeLa cell line）是生物学与医学研究中使用的源自一位名叫Henrietta Lacks美国妇女的子宫颈癌细胞的细胞系。这名美国妇女在1951年死于该癌症。为了让Lacks保持匿名，此细胞株原宣称是依“Helen Lane”命名。海拉细胞系被视为“不死的”（即不同于其它一般的人类细胞，此细胞株不会衰老致死，并可以无限分裂下去），至今都被不间断的培养。此细胞系跟其它癌细胞相比，增殖异常迅速。海拉细胞系是被人类乳突状瘤病毒第18型（Human Papillomavirus 18）转化的，和正常子宫颈细胞有许多不同。是一种典型的抗肿瘤药物研究材料。 2.2接种 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为2～3?104/ml，每孔加入细胞悬液200μl，使每孔内的细胞数为4000- 6000个。 2.3 培养与药物处理 培养箱内培养24～36h，吸出培养液加入不同浓度梯度（50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml、400ug/ml）的5-氟尿嘧啶各200 μl，每个浓度接种4孔作为重复实验，以提高实验数据的准确性。同时，设置一个调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），和一个对照孔（细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜），为后面的实验做好准备。 2.4 呈色 培养箱内继续培养到第3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5 mg/ml的MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，终止培养；快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液；然后每孔加DMSO 150μl，振荡30min，使结